重组Tth DNA聚合酶基因的克隆表达及活性鉴定

论文摘要

Tth DNA聚合酶具有聚合酶与反转录酶两种功能,而且耐高温,但是国内并未实现高效生产.本研究以粗提的嗜热栖热菌Thermus thermophilus基因组为模板,采用PCR分段扩增和酶切连接的方法获得Tth DNA聚合酶基因全长序列;然后构建重组质粒pXT99b/Tth并转化表达菌E.coli DH5α,利用IPTG诱导Tth基因表达,并采用热处理、Ni2+柱纯化融合His-tag的Tth DNA聚合酶,最后利用PCR、RT-PCR鉴定其活性.结果显示,本研究获得Tth DNA聚合酶基因全长2 505bp,成功表达并获得高纯度高活性的重组Tth DNA聚合酶,1L发酵液所得粗酶液中,酶活性约有800 000U,酶的比活约为6 315U/mg.本研究最终实现了Tth DNA聚合酶的高效国产化并降低了实验成本.

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌株和质粒
•   1.2 药剂
•   1.3 方法
•     1.3.1 Tth DNA聚合酶基因的分段扩增克隆
•     1.3.2 Tth DNA聚合酶基因的拼接
•     1.3.3 Tth DNA聚合酶基因表达质粒的构建
•     1.3.4 重组Tth DNA聚合酶基因的诱导表达
•     1.3.5 重组Tth DNA聚合酶的纯化
•     1.3.6 纯化后Tth DNA聚合酶活性鉴定
• 2 结果与分析
•   2.1 Tth DNA聚合酶基因分段扩增结果
•   2.2 Tth DNA聚合酶全长基因的拼接和克隆测序结果
•   2.3 Tth表达载体构建和诱导表达结果
•   2.4 重组Tth DNA聚合酶的纯化结果
•   2.5 重组Tth DNA聚合酶的活性鉴定结果
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李华,杨玲玲,杜红旗

关键词: 基因克隆,酶活

来源: 河南大学学报(自然科学版) 2019年03期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 郑州工程技术学院化工食品学院,河南省农业科学院畜牧兽医研究所

基金: 河南省博士后科研项目启动经费资助(19030086)

分类号: Q78

DOI: 10.15991/j.cnki.411100.2019.03.007

页码: 311-317

总页数: 7

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