利用CRISPR/Cas9技术构建Gqi9基因敲入的HEK293细胞系

论文摘要

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）是最大的膜表面受体家族,人类基因组有800多个GPCRs蛋白编码基因。GPCR介导的信号通路参与调控人类多种生理过程,GPCR功能失调与多种疾病的发生密切相关,因此该受体家族是非常重要的药物靶点。GPCR被激活后可以偶联不同G蛋白介导经典的G蛋白依赖信号通路,G蛋白的激活会导致胞内产生第二信使,从而引发细胞内一系列生化反应。G蛋白分为4大类:Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13。其中Gs和Gq/11亚型被激活后,分别会引起胞内第二信使cAMP、Ca2+浓度的升高,与之相反,Gi蛋白的激活会抑制腺苷酸环化酶活性,导致cAMP水平下降,但该信号无法直接进行检测,使Gi蛋白偶联受体相关研究相对繁琐。Gqi9蛋白是将Gq蛋白α亚基C端的9个氨基酸替换为Gi蛋白相对应的氨基酸,以此改变了G蛋白偶联GPCR的特异性,该嵌合体蛋白既可以被偶联Gi蛋白的受体激活,也可以介导Gq蛋白下游信号通路。Gqi9蛋白的出现为Gi蛋白偶联受体研究提供了有效的工具,目前都是采用Gqi9蛋白与受体共同转染的方式进行研究,但该方法具有表达不稳定以及表达不均一等缺点,因此本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Gqi9基因敲入的HEK293细胞系,以实现Gqi9蛋白的稳定内源性表达。我们设计将Gqi9基因序列敲入目前使用最广泛的基因“安全港”AAVS1位点,研究报道该位点可以保证外源基因的正常转录,且在该位点插入外源基因对细胞无已知副作用。最后,在得到Gqi9基因敲入单克隆细胞系后,借助PCR、qPCR、荧光钙信号检测等方法对Gqi9基因表达以及Gqi9蛋白功能进行检测,实验结果显示该细胞系可以稳定表达Gqi9基因,且在该细胞系内外源表达偶联Gi蛋白的受体后可以检测到胞内钙信号的升高。综上所述,本论文为Gi蛋白偶联受体的研究提供了有效的工具细胞系,克服了以往研究方法的缺点。该细胞系可以用于Gi蛋白偶联受体的结构与功能研究,也为针对该类受体的药物筛选以及多种突变体研究提供极大的便利,且本研究也为构建其它工具细胞系提供参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 G蛋白依赖的信号通路
•   1.2 Gqi9 蛋白的简介及应用
•   1.3 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
•   1.4 本课题的研究目的、内容和意义
• 2 实验技术原理
•   2.1 脂质体转染
•   2.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
•   2.3 流式细胞分选技术
•   2.4 实时荧光定量PCR
•   2.5 荧光探针法检测细胞内钙离子浓度变化
• 3 材料与方法
•   3.1 实验材料
•   3.2 实验方法
•   3.3 统计分析
• 4 实验结果与讨论
•   4.1 实验结果
•   4.2 总结与讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录 主要符号和缩略词表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周芮

导师: 刘剑峰

关键词: 蛋白偶联受体,系统,基因敲入

来源: 华中科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 华中科技大学

分类号: Q78

DOI: 10.27157/d.cnki.ghzku.2019.004552

总页数: 49

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