导读:本文包含了菊粉内切酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:菊粉,内切,果糖,曲霉,酵母,基因工程,基因。
菊粉内切酶论文文献综述
白洋[1]（2016）在《菊粉内切酶在毕赤酵母GS115中的表达及酶法生产低聚果糖》一文中研究指出菊粉广泛存在于菊芋、菊苣、大丽花等多种植物的根茎中,其中菊芋在我国各地区广泛存在,菊粉在菊芋块茎的干重中可占到40%～70%,菊芋耐寒、抗旱、繁殖快、耐盐碱的特性可使得其在荒漠、盐碱地等地区。低聚果糖作为一种优良的水溶性膳食纤维,具有不可消化和低热值、改善脂代谢、调节肠道微生物菌群、促进矿物质吸收等功效,是符合益生元标准的双歧因子,以其优越的生理功能成为近十年来国际食品市场上广泛流行的功能性食品配料。以菊粉为原料用菊粉内切酶法生产低聚果糖的方法具有工艺简单、杂糖少、后续除糖方便的优点,适合工业化大规模生产。本文中通过用融合标签化的技术在菊粉内切酶基因的5'端和3'端加上编码酸性或碱性氨基酸标签的基因序列并在毕赤酵母中成功地表达,摇瓶诱导发酵考察了标签化酶的酶活,酸性标签化的重组酶酶活性要高于碱性标签化酶的酶活,而且12个酸性氨基酸标签化的菊粉内切酶酶活与野生型菊粉内切酶酶活相近,初步验证了这种标签化处理在这种菊粉内切酶的应用上的可行性。构建了标签化INU2的双表达盒重组酵母菌株,通过摇瓶发酵考察INU2的表达酶活,并与pPIC9K-INU2aa进行了比较。在摇瓶诱导培养的条件下,两个拷贝菌株的菌体量比单拷贝的菌株要降低近1/4,在酶活方面INU2-6A有一定的提高,INU2-6B、INU2-12A的两拷贝菌株酶活与单拷贝菌株的酶活相当,INU2-12B的两拷贝菌株比单拷贝菌株的酶活降低了 14.34%。用阴离子交换树脂和阳离子交换树脂固定化标签化菊粉内切酶和野生型菊粉内切酶,从蛋白固定化效率方面分析,添加碱性氨基酸标签增加了阳离子树脂对菊粉酶的固定化效率,但是酶活固定化效率偏低。用氨基树脂EA固定化未标签化的菊粉内切酶,酶活最高为115.23U/g,固定化效率达到了 79.17%。确定了菊粉内切酶水解菊粉生产低聚果糖的最佳反应条件为游离酶在55℃条件下,70U/g,反应时间5h;确定了以用2%的戊二醛处理过的EA树脂为载体,固定化葡萄糖氧化酶的酶活最高为52.78U/g,而且重复利用10次后酶活仍然保留41.1U/g;比较了不同菊粉内切酶与菊粉反应产物的分析并比较几种除糖方法,初步验证了葡萄糖异构酶与葡萄糖氧化酶联用法在除糖中应用中的可行性。(本文来源于《山东大学》期刊2016-05-23）
林胜强[2]（2014）在《高产菊粉内切酶多拷贝基因工程菌株的构建和表达研究》一文中研究指出菊芋耐寒、耐旱能力强,繁殖快,根块产量高,病虫害少,可充分利用荒地、盐碱地、荒漠地区种植,不仅不占用耕地良田,而且能够改善土壤和治理土地荒漠化。菊芋在我国各地区广泛存在,块茎中富含菊粉,可以利用微生物发酵或酶解等生物转化的方法来生产高附加值的高果糖浆、低聚果糖、其它发酵制品和生物燃料等产品。β-键连接的低聚果糖(Inulooligosaccharides,IOS)是功能性低聚糖,在食品、医药等方面具有极大的应用价值,具有难消化性、食物纤维的作用、低龋齿性、促进双歧杆菌的增殖、改善脂质代谢作用等优越性,适合现代人们对食品安全性、健康性及功能性等需求的特点,逐渐成为菊粉生物转化应用极其重要的方向。低聚果糖的生产方法主要有两种:一种是以蔗糖为原料利用呋喃果糖苷转移酶(Frucofranosidase)作用来制备,该方法的缺点是反应产物中生成大量的葡萄糖,通常占到35%以上,去除难度大,导致其生产成本的增加;另一种方法是以菊粉为原料利用微生物生产的内切型菊粉酶酶解制备低聚果糖,该方法的优点是只需一步酶解就可以生成80%以上的高纯度低聚果糖,产物中的葡萄糖含量极低,又由于菊粉的来源丰富,价格便宜,使得该方法具有非常广阔的应用前景。用菊粉酶法生产低聚果糖的工艺,对微生物具有较高要求,首先微生物所产的酶液中只能有内切型菊粉酶,而不能有外切酶及转移酶的存在;第二是微生物所产酶液中菊粉酶的酶活力要高、稳定性要好。因此,获得优良的产菊粉内切酶微生物是工业以菊粉生产低聚果糖的关键。然而自然界中,微生物所产的菊粉酶既含有内切酶也含有外切酶,通过基因重组技术,将菊粉内切酶基因克隆表达在稳定的表达系统中,从而获得单一的菊粉内切酶。本研究从无花果曲霉ATCC16882菌株中克隆了菊粉内切酶inu2基因,插入pPIC9K质粒,转入毕赤酵母GS115中,通过抗生素G418的筛选重组子,用实时荧光定量PCR方法确定了重组子拷贝数分别为1、2、3、5的菊粉内切酶INU2重组毕赤酵母菌株INU2-1、INU2-2、INU2-3、INU2-5,并对多拷贝重组子进行甲醇诱导发酵,发现多拷贝重组子比单拷贝的inu2产量高,在摇瓶培养下,3拷贝、5拷贝转化子的产酶量相当,最高菊粉酶酶活达到570 U/ml。对3拷贝转化子INU2-3进行3 L发酵罐高密度补料诱导发酵,甲醇诱导7天后,发酵上清液中的菊粉内切酶酶活达到了 2190 U/ml。构建了 3拷贝inu2表达盒重组质粒pGAPZα A-3INU2,并将该质粒电转到INU2-3重组菌株上,获得了转化子,通过实时荧光定量PCR实验,确定整合进了 2拷贝的GAP组成型inu2表达盒,对这株拥有5拷贝的双启动子重组菌株INU2-A3-G2进行3 L发酵罐的高密度补料诱导发酵,甲醇诱导204小时后酶活达到了 3006 U/ml,是目前文献报道最高酶活的2.2倍。重组INU2粗酶液作用于底物菊粉,对产物进行薄层层析,结果表明INU2彻底酶解菊粉的终产物中,单糖占有12.4%,二糖占有10.6%,而叁糖占了 77.0%,可以用于低聚果糖的生产。对发酵粗酶液进行硫酸铵盐析研究结果表明,当pH为4,硫酸铵饱和度为50%,重组蛋白的盐析效果最好,盐析效率达到65.4%。对INU2酶液保护剂进行了研究,获得复合保护剂最佳配方为CaCl2 15 mmol/L、蔗糖40%、山梨醇50%,保护效果良好,可以用于酶制剂的生产保存。(本文来源于《山东大学》期刊2014-05-31）
李阳[3]（2014）在《菊粉内切酶和蔗糖酶基因的高效重组表达及其在水解菊粉中的应用》一文中研究指出菊粉酶(Inulinase)是一种呋喃果糖基水解酶，它靶向作用于菊粉中的β-2,1糖苷键并将其水解为果糖和葡萄糖。菊粉酶可以分为菊粉外切酶和菊粉内切酶。菊粉外切酶可以从菊粉分子的非还原末端催化水解下β-D-呋喃果糖残基，其底物可为菊粉、蔗糖和果聚糖；菊粉内切酶可以水解菊粉内部的β-2,1糖苷键使其变成菊糖叁糖、菊糖四糖和菊糖五糖为主的菊粉寡糖。蔗糖酶(Invertase)是一种β-呋喃果糖苷酶，它可以催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、高等植物和许多动物细胞中。其中，酒精酵母的蔗糖酶已被深入研究，并广泛应用于食品和发酵工业。酒精酵母的蔗糖酶主要是由SUC2基因编码的。本研究首先将节杆菌属Arthrobacter sp. S37来源的菊粉内切酶基因EnIA在酵母菌解脂亚罗维亚中表达，并研究了重组菊粉内切酶的性质及水解菊粉的产物。将菊粉内切酶基因EnIA连接到表达质粒pINA1317上，在Yarrowia lipolytica Po1h中进行分泌表达。重组转化子1317-EnIA生产的重组菊粉内切酶的酶活力和比活力大小分别为16.7U/mL和93.4U/mg，表观分子量大小为78.9kDa。重组酶的最适pH值为4.0，在pH2.0-8.0范围内，重组酶可以保持较高的活性。在40℃以下，重组酶有很好的稳定性，其最适作用温度为50℃。Li+离子对重组酶活性有激活作用。重组菊粉内切酶水解菊粉的主要产物为菊粉二糖。当把重组菊粉内切酶和菊粉外切酶混合水解菊粉时，混合物的菊粉酶活力大于两者菊粉酶相加之和，表现出协同作用。本实验室保藏的一株高产酒精酵母Saccharomyces sp. W0菌株可以缓慢地糖化菊粉产生单糖，利用菊粉发酵生产少量的酒精。将菊粉内切酶基因EnIA在酒精酵母W0菌株中表达，提高W0菌株的菊粉酶活力和酒精产量。把菊粉内切酶基因EnIA连接到酒精酵母表达载体pMIDSC31（δ序列插入型）和pMIRSC31（rDNA序列插入型）上，整合到W0菌株的基因组DNA中。δ序列插入型重组转化子D5的菊粉酶活力高于rDNA序列插入型重组转化子R1。重组转化子D5的菊粉酶活力达8.6U/mL。在5-L发酵罐体系中，转化子D5以菊粉含量为30%（w/v）的培养基进行酒精发酵，酒精产量为13.6%（v/v,20℃）。转化子D5同步糖化生料菊芋粉，在1-L发酵体系中，酒精产量达10.1%（v/v,20℃）。W0菌株具有很低的菊粉酶活性，根据氨基酸序列的多重比对分析结果推测可能与蔗糖酶基因SUC2相关。蔗糖酶基因SUC2与酒精酵母具有菊粉酶活力可以发酵菊粉生产酒精之间的关系还鲜有报道。本研究将SUC2基因完全敲除并将原始SUC2基因在敲除菌株中超表达，根据敲除和超表达之后的实验结果解释蔗糖酶基因SUC2与W0菌株具有菊粉酶活性是否相关。蔗糖酶基因SUC2被敲除后，完全敲除菌株W4失去蔗糖酶和菊粉酶活力，不能在以蔗糖或菊粉为唯一碳源的培养基中正常生长，可以在以果糖为唯一碳源的培养基中生长。在敲除菌株W4中超表达蔗糖酶SUC2基因，超表达转化子SUC2-1的SUC2基因表达量为W0菌株的113.6倍，蔗糖酶和菊粉酶活力分别是W0菌株的2.53倍和6.60倍。SUC2基因超表达转化子水解菊粉的产物是单糖，可以利用30%（w/v）的菊粉发酵培养基生产13.4%（v/v,20℃）的酒精。在1-L发酵体系中，超表达转化子SUC2-1同步糖化生料菊芋粉的酒精产量达10.9%（v/v,20℃）。本实验首次证明W0菌株的SUC2基因与其胞外和胞内菊粉酶活性有关，也证明了在W0菌株中超表达蔗糖酶的技术也可应用到酒精发酵工业上。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2014-05-27）
张帆,陈晟,段绪果,刘旭,杨冬[4]（2011）在《Aspergillus niger菊粉内切酶的生产及应用》一文中研究指出菊粉酶是能够水解菊粉的β-2,1-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶。根据菊粉酶酶切果聚糖链的方式可分为菊粉内切酶(EC3.2.1.7)和菊粉外切酶(EC3.2.1.80)。菊粉内切酶仅作用于菊粉,随机断开菊粉链内部的糖苷键,产生一系列的低聚果糖(主要为低聚叁糖、四糖和五糖)。低聚果糖是理想的蔗糖替代品,具有增殖双歧杆菌、调节脂肪代谢、促进矿物元素吸收、降低血糖、抑制内毒素、保护肝脏等功能,因此是食品和饲料的重要添加剂。国内低聚果糖的工业化生产主要以蔗糖为原料,生产成本高,产品有效成分含量低。而以菊粉为原料利用菊粉内切酶制备低聚果糖具有原料来源广泛,价格低廉,酶催化效率高,产品品质高等优势,越来越受到国内外研究者的重视。国外对菊粉内切酶已进行了深入的研究,并且日本、比利时等国已实现工业化生产。我国对菊粉内切酶的研究起步较晚,主要集中在酶高产菌株的筛选和酶学性质方面,所得菊粉内切酶的酶活及效率相对较低,导致目前国内菊粉内切酶市场完全被国外企业垄断,以菊粉为原料利用菊粉内切酶制备低聚果糖未能实现工业化生产。本研究采用实验室保藏的黑曲霉为出发菌株,将其菊粉内切酶基因克隆,连接至表达载体Inu-pPIC9k,并在Pichia pastoris中实现高效表达。该重组菌在3L发酵罐上进行发酵条件优化,最终发酵上清液酶活达到128U/mL,达到国际先进水平。将该重组菊粉内切酶进行低聚果糖生产实验,以价格低廉的30%粗菊粉作为底物(pH5.5磷酸缓冲液),50℃反应14h后,低聚果糖产率高达75%以上,表明该重组菊粉内切酶具有优良特性,该研究为实现我国以菊粉为原料制备低聚果糖奠定坚实基础。(本文来源于《第八届中国酶工程学术研讨会论文集》期刊2011-10-10）
王志园[5]（2010）在《菊粉内切酶产生菌的选育鉴定及其发酵条件优化》一文中研究指出低聚果糖具有显着的营养和保健功能。研究菊粉内切酶水解菊粉生产低聚果糖,选育菊粉内切酶高产菌株,是功能性低聚糖研究中的热点课题。①产菊粉内切酶菌株的分离筛选及鉴定：从西北农林科技大学生物园土壤中采样,以菊粉为底物,松叁糖为选择性鉴别碳源,平板分离纯化出6株产菊粉内切酶菌株。以酶活I／S值作为复筛标准,筛选出2株产菊粉内切酶酶活相对较高的菌株,标记为NCM和NSY5,它们的摇瓶初始酶活I／S值分别为17.82,12.40。通过菌落形态、菌丝及孢子形态以及生理生化特性分析,初步鉴定命名为：柱隔孢霉Ramularia NCM和克鲁维酵母Kluveromyces NSY5。②发酵条件优化研究：在单因素实验基础上,采用Plackett-Burman实验设计对影响Kluveromyces NSY5发酵产菊粉内切酶的碳源、氮源、无机盐、发酵时间等8个选择因素进行评估,结果显示培养基的菊芋汁浓度、摇瓶装液量和发酵时间对菌株发酵产酶具有显着影响。根据实验结果和经验方法对显着影响因素的优化取值范围进行预估,用Box-Behnken中心组合实验和响应面寻优分析找出显着影响因素的极优值,验证实验结果显示,采用优化的菊芋汁浓度3.5%、装液量50ml/250ml、发酵时间56h,Kluveromyces NSY5摇瓶发酵液中的菊粉内切酶I/S值达到18.29,比初始发酵条件下的菊粉内切酶I／S值12.40提高47.50%,优化预测值和实验验证值的相对误差为0.26%。③菌株诱变育种研究：以菌株Kluveromyces NSY5为出发菌,经UV(20W、距30cm辐照110S)、微波辐射15min协同多轮诱变处理,选育出一株突变株Kluveromyces NSY54W,其发酵菊粉内切酶酶活(I／S)较出发菌株提高了32.95%。(本文来源于《南昌大学》期刊2010-06-01）
段学辉,王志园,李强[6]（2010）在《一株产菊粉内切酶酵母Kluveromyces NSY5发酵条件优化》一文中研究指出在单因素实验基础上,采用Plackett-Burman实验设计对影响KluveromycesNSY5发酵产菊粉内切酶的碳源、氮源、无机盐、发酵时间等8个选择因素进行筛选,结果显示,培养基的菊芋汁浓度、摇瓶装液量和发酵时间对菌株发酵产酶具有显着影响。根据实验结果和经验方法对显着影响因素的优化取值范围进行预估,并选择适当的水平设计,用Box-Behnken中心组合实验和响应面寻优分析找出显着影响因素的极优值,验证实验结果表明,采用优化的菊芋汁浓度3.5%、装液量50 mL/250 mL、发酵时间56 h,KluveromycesNSY5摇瓶发酵液中的菊粉内切酶I/S比值达到18.29,比初始发酵条件下的菊粉内切酶I/S比值12.4提高47.5%,优化预测值和实验验证值的相对误差为0.26%。(本文来源于《南昌大学学报(工科版)》期刊2010年01期）
华承伟,谢凤珍,王建华,史贤明[7]（2007）在《毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究》一文中研究指出目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540 U/mL。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2007年01期）
滕达[8]（2006）在《菊粉内切酶基因克隆、表达及菊寡糖中试设计》一文中研究指出菊粉是一种天然果聚糖,菊粉内切酶能够水解菊粉生成低聚果糖,低聚果糖是一种功能性食品添加剂,其保健作用体现在能够降低血糖水平,促进人体和动物肠道的微生态平衡和提高免疫力等等。利用微生物菊粉内切酶可以一步法水解菊粉获得高达80%的低聚果糖,但是只有少数微生物产菊粉内切酶,并且产酶量极低,从而造成分离纯化困难,制约低聚果糖工业的发展。本研究的主要目的就是构建菊粉内切酶的工程酵母来高效表达菊粉内切酶,为解决目前低聚果糖生产中的问题提供有效的解决途径。 本研究以黑曲霉9891的基因组DNA为模板进行PCR扩增获得了编码菊粉内切酶的基因,并将它克隆进表达载体pPIC9,经过酶切、PCR和测序验证后,将重组表达载体pPIC9-Endoinu经BglⅡ酶切线性化后电转化到Pichia pastoris GS115中。重组子通过营养缺陷型培养基进行筛选。重组菊粉内切酶在Pichia pastoris GS115中实现了表达并在7L发酵罐中对其进行了优化表达研究,蛋白分泌量达2.15mg/ml。表达产物的SDS-PAGE分析表明,蛋白质分子量大小约为59KD。菊粉内切酶的活性测定结果为1501U/ml(以蔗糖为底物)和291U/ml(以菊粉为底物),同原始供体菌株相比,分别高105倍和273倍,通过酶学特性研究显示该酶反应最适pH为5.6,最适温度是55℃。同时还对菊粉内切酶的高级结构进行了模拟,得到了该蛋白的高级结构的初步信息。根据SDS-PAGE电泳和酶的功能性分析,证明目的蛋白已在Pichia pastoris中成功实现表达。且重组转化子-Pichia pastoris GS115/9891(I1-27)遗传稳定性良好。同时完成了中试生产线建设设计方案,包括菊粉内切酶水解生产菊粉寡糖的工艺设计;设备选型;低聚果糖工艺生产设备平面布置初步方案等酶法生产菊粉寡糖的生化工程的下游工作。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2006-05-01）
华承伟,王建华,滕达,史贤明[9]（2004）在《菊粉化学和微生物菊粉内切酶研究进展》一文中研究指出菊糖作为多聚果糖类碳水化合物,其物理化学性质已较早地得到研究,之后菊糖分子结构得到深入的研究。近年以开发菊粉系列产品作为功能性食品成分为目标,关于微生物菊粉内切酶酶学性质、基因结构、工程菌株构建与生产应用方面的研究进展迅速,如已经成功地构建2种高表达内切菊粉酶的基因工程酵母。本世纪菊粉生物技术将大力推动菊粉产业的发展。(本文来源于《中国食品学报》期刊2004年04期）
华承伟[10]（2004）在《基因工程菊粉内切酶毕赤酵母表达优化与菊寡糖制备研究》一文中研究指出菊糖是一种天然的果聚糖，是植物体内的一种储藏性碳水化合物。菊糖一般由30-60个果糖单位组成，菊粉寡糖是由2-10个果糖单位组成的一种功能性的糖。近年在开发菊粉系列产品时是以菊粉寡糖这一功能成分为研究目标的，利用微生物菊粉内切酶进行菊粉寡糖的生产成为现在开发菊粉系列产品的研究热点，但大多天然微生物分泌的菊粉酶为外切酶或外切酶和内切酶的混合物，只有少数微生物产菊粉内切酶，并且其含量甚微、从而使分离纯化困难，不利于工业化生产。因此国内外关于微生物菊粉内切酶酶学性质、基因结构、工程菌株构建与生产应用方面的研究进展迅速，王建华小组已成功构建两株能高效表达菊粉内切酶的基因工程酵母，本实验利用其中一株基因工程酵母一毕赤嗜甲醇酵母(Pichia methanolica)进行高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶，并对用于指导生产实践的酶的一些特性进行了研究，利用菊苣为原料，采用现代生物技术和分析技术，对菊粉的提取和菊粉寡糖的生产进行了较深入细致的研究，这对菊粉寡糖的工业化生产具有一定的指导意义。主要结果如下： 1 菊粉内切酶基因的表达 1．1 摇瓶培养：通过不同碳源、不同诱导培养基、微量元素的浓度、菌体密度、pH值、甲醇浓度、甲醇诱导周期对酶蛋白表达的影响研究，对高密度培养的培养基进行了优化。结果表明：重组酵母对碳源利用的优先顺序为葡萄糖、果糖、甘油、甲醇和乙醇；微量元素浓度添加量为100mL／L时酵母生长良好；采用BMMY诱导培养基，菌体密度控制在OD_(600)=100，pH值在7.0左右，甲醇浓度为0.1％，诱导96h时，酶活达到最大，为35U／mL，优于INVITROGEN标准操作系统。重组酵母在此条件下的表达量是原始菌株黑曲霉9891(Aspergillus niger 9891)的10倍左右；对影响酵母生长最重要的两个因素葡萄糖和硫酸铵进行二因素二水平的正交试验，结果表明葡萄糖浓度为40g／L、硫酸铵添加量为11.5g／L时，酵母生长为最好。 1．2 高密度培养：采用叁种培养基F_1、F_2、和F_3进行试验，分别测定酵母的生长曲线，都符合指数生长曲线，细胞生长延迟期分别为1.36h，2.29h，2.48h，比生长速率μ分别为0.4846h~(-1)，0.2856h~(-1)，0.2813h~(-1)。采用F_1培养基时，其优点是不产生沉淀，酵母生长速度快，培养周期短。补料-分批培养阶段采用指数补料策略，诱导方式采用葡萄糖—甲醇混合诱导和100％甲醇单一诱导相结合，培养条件控制如下：pH值6.0，DO2004硕士学位论文大于30%，温度30℃，甲醇浓度为0.1%左右。在菌体鲜重(Fw)为280岁L左右时连续诱导96h，菌体不会出现自溶，酶活可达112U/mL，单位菌体鲜重酶活(U/g，FW)达0.36单位。2酶的特性研究表明，酶作用的最适温度为55℃，高于60℃时开始失活;其最佳pH为5.5，在pH4.5到pH6.5时较为稳定;HgZ+、PbZ+、BaZ+对酶活具有显着抑制作用;eaZ+能显着提高酶活，Mg2+、Fe3+、cu2+、zn2+对酶活作用不明显;EDTA对酶活具有部分抑制作用。酶底物研究表明，酶水解菊粉，但不水解棉子糖，水解蔗糖活性较低。3在菊粉提取试验中，采用干菊芭粉用循环方式进行水抽提，在料液比为1:15，温度为80℃，浸提时间为2h时提取率达98%。采用干制菊芭作为提取菊粉的原料，克服了鲜菊芭保鲜困难的缺点，这利于工业化生产;在对总糖进行酸解法测定时，菊芭粉和菊粉提取液中总糖的测定条件采用0.2mo呱HCI水解4Omin时，可提高测定结果准确度。4在酶解试验中，菊粉浓度为200创L(即接近最大溶解度)时，反应30h，菊粉寡糖最大产率为62.0%，菊粉寡糖的最大产率与酶的用量无关，但随着酶浓度的提高，菊粉寡糖达到最大产率的时间逐渐缩短。酶用量为12U/g菊粉时，达到最大产率的时间为20一30h，菊粉浓度为40留L时，寡聚糖达到最大产率64.6%。对产物的TLc和离子色谱分析表明，酶解产物主要为GF:到GFI。的菊粉寡糖，产物的生成与酶解时间关系较小，这有利于生产的控制。(本文来源于《华中农业大学》期刊2004-05-01）
菊粉内切酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
菊芋耐寒、耐旱能力强,繁殖快,根块产量高,病虫害少,可充分利用荒地、盐碱地、荒漠地区种植,不仅不占用耕地良田,而且能够改善土壤和治理土地荒漠化。菊芋在我国各地区广泛存在,块茎中富含菊粉,可以利用微生物发酵或酶解等生物转化的方法来生产高附加值的高果糖浆、低聚果糖、其它发酵制品和生物燃料等产品。β-键连接的低聚果糖(Inulooligosaccharides,IOS)是功能性低聚糖,在食品、医药等方面具有极大的应用价值,具有难消化性、食物纤维的作用、低龋齿性、促进双歧杆菌的增殖、改善脂质代谢作用等优越性,适合现代人们对食品安全性、健康性及功能性等需求的特点,逐渐成为菊粉生物转化应用极其重要的方向。低聚果糖的生产方法主要有两种:一种是以蔗糖为原料利用呋喃果糖苷转移酶(Frucofranosidase)作用来制备,该方法的缺点是反应产物中生成大量的葡萄糖,通常占到35%以上,去除难度大,导致其生产成本的增加;另一种方法是以菊粉为原料利用微生物生产的内切型菊粉酶酶解制备低聚果糖,该方法的优点是只需一步酶解就可以生成80%以上的高纯度低聚果糖,产物中的葡萄糖含量极低,又由于菊粉的来源丰富,价格便宜,使得该方法具有非常广阔的应用前景。用菊粉酶法生产低聚果糖的工艺,对微生物具有较高要求,首先微生物所产的酶液中只能有内切型菊粉酶,而不能有外切酶及转移酶的存在;第二是微生物所产酶液中菊粉酶的酶活力要高、稳定性要好。因此,获得优良的产菊粉内切酶微生物是工业以菊粉生产低聚果糖的关键。然而自然界中,微生物所产的菊粉酶既含有内切酶也含有外切酶,通过基因重组技术,将菊粉内切酶基因克隆表达在稳定的表达系统中,从而获得单一的菊粉内切酶。本研究从无花果曲霉ATCC16882菌株中克隆了菊粉内切酶inu2基因,插入pPIC9K质粒,转入毕赤酵母GS115中,通过抗生素G418的筛选重组子,用实时荧光定量PCR方法确定了重组子拷贝数分别为1、2、3、5的菊粉内切酶INU2重组毕赤酵母菌株INU2-1、INU2-2、INU2-3、INU2-5,并对多拷贝重组子进行甲醇诱导发酵,发现多拷贝重组子比单拷贝的inu2产量高,在摇瓶培养下,3拷贝、5拷贝转化子的产酶量相当,最高菊粉酶酶活达到570 U/ml。对3拷贝转化子INU2-3进行3 L发酵罐高密度补料诱导发酵,甲醇诱导7天后,发酵上清液中的菊粉内切酶酶活达到了 2190 U/ml。构建了 3拷贝inu2表达盒重组质粒pGAPZα A-3INU2,并将该质粒电转到INU2-3重组菌株上,获得了转化子,通过实时荧光定量PCR实验,确定整合进了 2拷贝的GAP组成型inu2表达盒,对这株拥有5拷贝的双启动子重组菌株INU2-A3-G2进行3 L发酵罐的高密度补料诱导发酵,甲醇诱导204小时后酶活达到了 3006 U/ml,是目前文献报道最高酶活的2.2倍。重组INU2粗酶液作用于底物菊粉,对产物进行薄层层析,结果表明INU2彻底酶解菊粉的终产物中,单糖占有12.4%,二糖占有10.6%,而叁糖占了 77.0%,可以用于低聚果糖的生产。对发酵粗酶液进行硫酸铵盐析研究结果表明,当pH为4,硫酸铵饱和度为50%,重组蛋白的盐析效果最好,盐析效率达到65.4%。对INU2酶液保护剂进行了研究,获得复合保护剂最佳配方为CaCl2 15 mmol/L、蔗糖40%、山梨醇50%,保护效果良好,可以用于酶制剂的生产保存。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
菊粉内切酶论文参考文献
[1].白洋.菊粉内切酶在毕赤酵母GS115中的表达及酶法生产低聚果糖[D].山东大学.2016
[2].林胜强.高产菊粉内切酶多拷贝基因工程菌株的构建和表达研究[D].山东大学.2014
[3].李阳.菊粉内切酶和蔗糖酶基因的高效重组表达及其在水解菊粉中的应用[D].中国海洋大学.2014
[4].张帆,陈晟,段绪果,刘旭,杨冬.Aspergillusniger菊粉内切酶的生产及应用[C].第八届中国酶工程学术研讨会论文集.2011
[5].王志园.菊粉内切酶产生菌的选育鉴定及其发酵条件优化[D].南昌大学.2010
[6].段学辉,王志园,李强.一株产菊粉内切酶酵母KluveromycesNSY5发酵条件优化[J].南昌大学学报(工科版).2010
[7].华承伟,谢凤珍,王建华,史贤明.毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究[J].生物技术通讯.2007
[8].滕达.菊粉内切酶基因克隆、表达及菊寡糖中试设计[D].中国农业科学院.2006
[9].华承伟,王建华,滕达,史贤明.菊粉化学和微生物菊粉内切酶研究进展[J].中国食品学报.2004
[10].华承伟.基因工程菊粉内切酶毕赤酵母表达优化与菊寡糖制备研究[D].华中农业大学.2004
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