基于罗氏真养菌CO2固定细胞工厂的构建

论文摘要

碳是作为大气中第四丰富的组份,是构建生命的基本元素。碳循环通过各种生物地球化学循环,在生命形态与环境之间穿梭,维持着地球的稳定与平衡。近代工业革命以来,二氧化碳排放量逐年增加,预计能够在2030年增至4030亿吨,2050年增至5000亿吨。因此人类迫切的需要采取一种有效率的方法避免或缓解由于环境和能源问题所产生对我们不利的影响。Ralstonia eutropha（R.eutropha）具有天然CO2固定能力,因此将其选为基底菌株。主线是更高效的完成从二氧化碳到有机物的生物合成。由于脂肪酸是高能量密度化合物,在工业,药品,营养,化妆品及日用品,组成细胞结构促进细胞膜流动性等方面具有重要作用。因此首先通过异源引入或自源过表达相应的脂肪酸合成代谢途径基因,从而改造其合成通路。最终的改造菌B2（pCT,pFP）在果糖为唯一碳源的条件下能够实现124.48 mg/g的自由脂肪酸的发酵生产,较对照菌H16提高了4倍。随后,为了开发一个真正的以H2,CO2和O2为底物的气体发酵系统,我们组装了相对安全,连续的,实验室剂量的气体发酵系统。H2由氢气发生器供应,并保持H2:O2的比例为7:1,整个系统置于通风橱内并配备气体检测装置用来保障实验安全。在这个系统中,B2（pCT,pFP）在以无机盐培养基内,48h的发酵时间能够产生60.64 mg/g的自由脂肪酸,氢气的供应总量为9*103 mL/L/h。为了进一步探究优化R.eutropha的CO2固定生长机理,我们首先尝试探究两个拷贝的CBB操纵子和两种氢化酶（MBH氢化酶及SH氢化酶）对自养生长是否存在主次之分,我们分别对双拷贝的CBB操纵子及两种氢化酶进行单敲和共敲实验,结果表明双拷贝的CBB操纵子无主次之分,而SH氢化酶相对于MBH氢化酶在自养生长上表现得更为重要。随后我们将R.eutropha的CO2固定能力优化内容分为三个部分:Rubisco相关的二氧化碳固定模块优化、氢化酶能量模块优化、前体物质供应模块优化三个模块优化。分别就不同模块进行相关代谢工程改造菌的构建和生长速度水平的评价。结果显示H16（pRubCynao-GroESLR）菌株是唯一个在二氧化碳固定模块具有正结果的改造,其生长速度与对照菌对比,在生长最大差异情况下提高了1 77.1%;在氢化酶模块优化实验中,我们首先分别过表达R.eutropha的四种氢化酶:膜连接氢化酶（MBH）,可溶性氢化酶（SH）,调节性氢化酶（RH）,假设性氢化酶（Hy4）,结果表明SH氢化酶和MBH氢化酶对菌体自养生长有增强作用,Hy4氢化酶的过表达生长情况与对照基本一致,RH氢化酶过表达对自养生长表现出抑制作用。随后为了消除多拷贝质粒对菌体生长的影响,在基因组水平上对MBH氢化酶及SH氢化酶的操纵子进行修饰,在启动子库里选择的BBaJ23119启动子表现出最强的自养生长能力增强作用,该改造菌C5M119S119就选择作为自养生长优化底盘菌株。前体物质供应模块优化我们也取得一定的成功,但是在共转过程中出现质粒无法共存现象,导致这部分的模块优化不能在本实验中使用。最终的模块整合菌实现了OD600的大幅度提高,PHB的自养发酵生产由0.17 g/g提高到0.34 g/g。本文发展一个真正的合成气发酵系统及并通过相应的分子生物学改造实现了自养脂肪酸细胞工厂的构建,同时也实现了R.eutropha的CO2固定能力在生长速度和产物积累水平上的初步提高。为解决大气二氧化碳浓度的持续升高和能源危机提供了一种可以选择的办法。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 引言
•   1.1 R.eutropha概述
•   1.2 脂肪酸的分类,命名和合成途径
•   1.3 微生物异源合成脂肪酸的研究进展
• 2固定机理'>  1.4 R.eutropha的CO₂固定机理
• 2固定的研究进展'>  1.5 微生物CO₂固定的研究进展
•   1.6 微生物氢化酶的研究进展
•   1.7 研究路线和意义
• 第2章 实验材料和方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 原始菌株和质粒
•     2.1.2 改造菌株和质粒
•     2.1.3 本文用到的引物
•     2.1.4 酶和试剂
•     2.1.5 仪器和设备
•     2.1.6 常用溶液和培养基
•     2.1.7 本文使用的质粒骨架
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 菌株的培养和冻存
•     2.2.2 质粒设计和构建
•     2.2.3 PCR片段的回收
•     2.2.4 质粒转入R.eutropha方法
•     2.2.5 合成气连续发酵系统的创建
•     2.2.6 合成气生长实验
•     2.2.7 脂肪酸和PHB的产量测定
• 第3章 自养脂肪酸细胞工厂的构建
•   3.1 自养发酵系统的创建
•   3.2 脂肪酸代谢通路的编辑优化
•   3.3 R.eutropha改造菌在自养和异样条件下的发酵
• 第4章 R.eutropha自养生长能力的优化
•   4.1 双拷贝CBB操纵子和MBH,SH氢化酶优先级探究
•   4.2 二氧化碳固定模块关键酶Rubisco的优化
•   4.3 氢化酶模块优化
•   4.4 碳酸酐酶对 R.eutropha自养生长的影响
• 2固定水平的评价'>  4.5 CO₂固定水平的评价
• 第5章 总结与展望
•   5.1 本文的研究总结
•   5.2 本研究内容展望
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 附录四
• 附录五
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李仲康

导师: 毕昌昊

关键词: 真养罗尔斯通氏菌,二氧化碳固定,代谢工程,脂肪酸发酵,发酵

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q813

总页数: 91

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