导读:本文包含了重组日血吸虫蛋白论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:血吸虫,日本,蛋白,半胱氨酸,免疫调节,细胞,疫苗。
重组日血吸虫蛋白论文文献综述
李慧民[1]（2019）在《日本血吸虫Sjp38MAPK基因编码cDNA的克隆、重组蛋白表达及其功能研究》一文中研究指出血吸虫需要雌雄虫配对和合抱以完成其发育成熟和产卵,并且成熟后血吸虫所产的产卵是造成宿主病理损伤的主要原因。因此,揭示参与血吸虫生殖发育相关的信号调控通路对开发新的防控策略具有重要意义。我们实验室前期通过磷酸化蛋白质组学研究发现Sjp38MAPK在日本血吸虫信号通路网络中是关键节点之一,为了阐明Sjp38MAPK在日本血吸虫的寄生和生殖发育过程中的作用,本研究对日本血吸虫Sjp38MAPK基因编码的cDNA进行了克隆,并对重组蛋白进行了表达及鉴定。另外,还对Sjp38MAPK在日本血吸虫不同发育阶段、雌雄虫的转录水平进行了分析。利用RNA干扰技术,抑制了Sjp38MAPK基因的转录,对Sjp38MAPK在日本血吸虫的生殖和发育中的功能进行了初步研究。具体包括以下叁个内容:(一)日本血吸虫Sjp38MAPK基因编码cDNA的克隆表达及生物信息学分析根据实验室前期蛋白质组学鉴定的Sjp38MAPK,设计引物,进行PCR扩增,序列分析表明该基因序列包含一个1038bp的开放阅读框,编码Sjp38MAPK蛋白,预测分子量为39.58kD。生物信息学分析表明Sjp38MAPK序列与曼氏血吸虫的同源性为93.48%,与埃及血吸虫的同源性为90.70%,与人和小家鼠的同源性均为57.10%。另外,还构建了原核重组质粒pET-32a(+)-Sjp38MAPK,成功诱导表达,并获得重组蛋白rSjp38MAPK,并用MALDI-TOF-TOF对重组蛋白进行了鉴定。(二)Sjp38MAPK在日本血吸虫不同发育时期和性别中的转录分析通过RT-qPCR方法检测Sjp38MAPK在日本血吸虫不同发育时期(虫卵、尾蚴和感染后第14d、21d、28d和35d)和雌雄虫(感染后14d、21d、28d和35d)中Sjp38MAPK的转录水平。结果显示,Sjp38MAPK在日本血吸虫尾蚴、虫卵、童虫和成虫时期均有表达,并且在成虫(21d、28d、35d)中的表达量显着高于虫卵、尾蚴和童虫时期。另外,在28d和35d时,Sjp38MAPK在雄虫中的表达显着高于雌性,表明Sjp38MAPK的转录具有发育时期和性别的差异性。(叁)日本血吸虫Sjp38MAPK的体外干扰利用电转的方法对日本血吸虫的Sjp38MAPK基因进行体外干扰,在转录水平上对干扰效果进行了分析,筛选出具有最佳干扰效果的小RNA分子(siRNA-977)。用Hoechst 33258荧光染料对干扰Sjp38MAPK后的血吸虫进行染色,观察并统计虫体活性。还用CellTiter-Lumi~(TM)法测定虫体细胞活性。此外,还利用RT-qPCR分析了干扰Sjp38MAPK后,日本血吸虫4种卵壳蛋白基因的mRNA表达水平。结果表明Sjp38MAPK干扰后,日本血吸虫虫体活性下降,死亡率增加;卵壳蛋白基因AY222895.1,M59318.1和D32205.1的转录水平显着降低,提示Sjp38MAPK可能在血吸虫生存和生长发育中发挥着重要的调控作用。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2019-05-01）
武艺,李路,徐永伟,邢瑞欣,胡静[2]（2019）在《日本血吸虫成虫可溶性蛋白和重组半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制小鼠结肠炎的研究（英文）》一文中研究指出目的探讨日本血吸虫可溶性成虫蛋白(SjSWP)和重组半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白(rSjcystatin)对模拟炎症性肠病的小鼠结肠炎的作用。方法 24只BALB/c雌鼠分为健康对照组、磷酸盐缓冲液组(PBS组)、rSjcystatin治疗组(rSjcystatin组)、 Sj SWP治疗组(SjSWP组)。PBS、 rSjcystatin、 SjSWP组用0.1 ml 5%2,4,6-叁硝基苯磺酸(TNBS)灌肠诱导结肠炎,灌肠后6、 24 h分别腹腔注射100μl PBS、 50μg r Sjcystatin、 50μg SjSWP;健康对照组在相应时间点用等量的PBS灌肠及腹腔注射。TNBS灌肠72 h后无痛处死各组小鼠,检测宏观评分、结肠长度、髓过氧化物酶活性和显微镜下微观评分来评估炎症参数和病理改变。流式细胞仪检测小鼠脾脏中Th1和Th2及T调节细胞(Tregs)的比例。ELISA检测小鼠结肠组织匀浆上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4 (IL-4)、 IL-13、 IL-10等炎性细胞因子的水平。多组计量资料分析采用单因素方差分析,多组均数间的两两比较用Student-Newman-Keuls检验。结果 TNBS诱导的结肠炎小鼠表现出明显的炎症和病理学特征,表现为体质量下降,便血、腹泻、结肠缩短、溃疡,以及炎性细胞因子IFN-γ、炎性细胞浸润和髓过氧化物酶活性的增加。与PBS组相比, rSjcystatin和SjSWP的干预治疗可以显着改善TNBS诱导的结肠炎症,表现为宏观评分(改善结肠糜烂、黏连、溃疡和缩短)和微观评分(减少组织损伤和炎症)的降低。健康对照组、 PBS组、 rSjcystatin组和SjSWP组小鼠结肠的宏观评分分别为0、 9.8±0.8、 4.3±1.0和4.5±1.4,微观评分分别为0、 6.0±0.4、 2.2±0.5和2.8±0.6,rSjcystatin组、 SjSWP组与PBS组相比差异均有统计学意义(F=57.8、 34.1, P <0.01), rSjcystatin组与SjSWP组间差异均无统计学意义(P> 0.05)。健康对照组、 PBS组、 rSjcystatin组和SjSWP组髓过氧化物酶分别为0.3±0.0、 1.4±0.1、 0.6±0.1和0.6±0.1 (F=32.5, P <0.01);脾脏Tregs比例分别为(4.4±0.7)%、(8.2±3.1)%、(18.4±2.1)%和(13.4±1.9)%(F=8.3, P <0.01);结肠组织匀浆上清中IFN-γ、 IL-10水平分别为(952.0±61.1)、(1 684.6±158.3)、(1 092.0±81.9)、(1 001.6±111.2) pg/ml,(322.8±27.4)、(399.3±77.9)、(860.6±153.6)、(892.0±113.8) pg/ml (F=9.6、 8.3, P <0.05);与PBS组相比, rSjcystatin与SjSWP组的INF-γ、髓过氧化物酶活性明显减低, Tregs应答增强, IL-10分泌增多,差异均有统计学意义(P <0.01), rSjcystatin组与SjSWP组间差异均无统计学意义(P> 0.05)。结论 SjSWP及rSjcystatin均可通过上调小鼠Treg和Th2介导的免疫应答,减轻小鼠实验性结肠炎,抑制导致结肠炎发病的Th1免疫应答。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2019年02期）
田添,王培,吕超,秦志强[3]（2018）在《日本血吸虫脂筏蛋白的重组表达及其生物信息学分析》一文中研究指出目的在大肠杆菌中原核表达、纯化日本血吸虫脂筏蛋白(rSjFLOTILLIN2),并对其进行生物信息学分析。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板扩增FLOTILLIN2基因片段,克隆至pET28a(+)质粒,经Xho I和EcoR I双酶切以及测序鉴定;重组质粒再转化入E. coli BL21,含重组质粒的菌株经IPTG诱导表达,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定目的蛋白分子量大小。同时采用生物信息学分析方法进行了序列比较和进化树分析。结果重组质粒(pET28a-FLOTLLIN2)经双酶切及测序鉴定,证明插入片段序列与预期目的基因序列符合。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,体外原核表达的重组蛋白(rSjFLOTILLIN2)分子量大小为48 kD,其与预测的分子量大小一致。经Blast搜索比对发现,日本叁角涡虫、白纹伊蚊、地中海果蝇、苜蓿切叶蜂等FLOTILLIN2序列与日本血吸虫FLOTILLIN2相似性最高;将日本血吸虫和热带爪蟾、原鸡等15种不同物种来源的FLOTILLIN2编码蛋白进行比较,并构建FLOTILLIN2系统进化树,系统发育分析结果显示,日本血吸虫与涡虫同为一支,遗传距离最为接近。结论日本血吸虫脂筏蛋白基因被成功克隆和表达,为进一步研究打下基础。(本文来源于《热带病与寄生虫学》期刊2018年02期）
张文月[4]（2016）在《重组蛋白Tat-TPI诱导的CD8~+T细胞应答参与抗日本血吸虫感染的保护性免疫研究》一文中研究指出血吸虫病是一种严重危害公共健康、影响社会发展的人兽共患寄生虫病。感染人类的血吸虫主要叁种,我国曾是日本血吸虫病严重流行的国家。尽管在过去的六十多年里我国已经采取了一系列血吸虫病综合防治策略并且获得了较好的成效,但是仍然面临许多挑战。根据最新的统计资料,截至2014年中国约有453多个血吸虫病流行县,其中居住人口达2.51亿,感染者多达11万人。吡喹酮是目前唯一用于血吸虫病治疗的有效药物。但是吡喹酮的治疗具有短效性,无法预防血吸虫的再次感染,且在疫区长期大规模的应用有可能提高药物的耐药性。因此,研制安全有效的日本血吸虫病疫苗是综合防治血吸虫病的重要目标之一。一般而言,抗血吸虫感染的免疫保护性机制认识多集中于CD4+T细胞和抗体应答上。首先,CD4+T细胞产生的IFN-γ被认为是关键因素。IFN-γ能够活化肺部的巨噬细胞产生NO,从而介导对血吸虫童虫的杀伤。其次,抗体应答在致弱疫苗诱导的保护力与血吸虫特异性IgG抗体水平呈正相关。但是CD8+T细胞在血吸虫感染中发挥的作用一直是人们争论的焦点。Tat-融合蛋白可以高效地转导到细胞中,被蛋白酶水解后经MHC-I类分子途径递呈给CD8+T淋巴细胞,从而能够优势诱导CD8+T细胞介导的免疫反应。在本研究中,我们构建了由蛋白质转导域HIV-1 TAT和日本血吸虫抗原Sj-TPI组成的重组蛋白Tat-TPI,评估了重组蛋白Tat-TPI的免疫原性及其在小鼠模型中的抗感染保护效果。本实验采用的重组蛋白表达方法有助于蛋白进入细胞内,从而提高CD8+T细胞和CD4+T细胞反应。本研究主要获得以下结果：1.表达、纯化重组蛋白Tat-TPI和TPI构建重组质粒pET-32a (+)-Tat-TPI和pET-32a (+)-TPI。将重组质粒转化至宿主菌BMRosetta (DE3)用于蛋白表达,经IPTG诱导表达和镍NTA琼脂糖凝胶FF纯化,获得纯化的重组蛋白Tat-TPI和TPI。2.重组蛋白被日本血吸虫感染小鼠血清识别纯化的重组蛋白Tat-TPI和TPI均能被日本血吸虫感染小鼠血清识别,说明重组蛋白具有良好的抗原性。3.小鼠胭窝淋巴结的免疫反应为了解重组蛋白Tat-TPI和TPI引起的免疫反应,我们以Tat-TPI、TPI和PBS分别经足垫免疫BALB/c小鼠,观察胭窝淋巴结的T细胞反应。在蛋白注射4天后,Tat-TPI和TPI组较PBS对照组相比均能激发小鼠胭窝淋巴结的Tcl反应(尸<0.01)。更重要的是,Tat-TPI较TPI更能有效地激发CD4+IFN-y+T细胞反应。4.CDS+T细胞能够辅助Thl应答为确定CD8+T细胞是否能辅助Thl应答,我们在体外利用抗小鼠CD8a抗体来封闭脾细胞中的CD8+T细胞。流式结果表明：与TPI相比,Tat-TPI能刺激脾细胞产生更高水平的CD3+CD4+IFN-y+T细胞。当CD8+T细胞封闭后,Tat-TPI组中CD4+IFN-y+T细胞比例出现显着性低于其他组的水平(P<0.05)。5.重组蛋白Tat-TPI和TPI免疫与日本血吸虫感染的免疫保护相关日本血吸虫尾蚴感染6周后,我们计算了小鼠的虫荷量和肝脏的卵荷量。与PBS对照组相比,Tat-TPI免疫组虽然没有达到预期的减虫率(11.9%)和肝脏减卵率(12.4%),但是叁次免疫可诱导产生较高水平的Th1、Tcl和IgG免疫应答,且显着减小肝脏中虫卵肉芽肿的面积。综上所述,本次研究成功表达了重组蛋白Tat-TPI,其免疫接种后有助于提高CD8+T细胞免疫应答,并辅助CD4+T细胞产生IFN-γ。虽然我们的免疫策略未达到理想的减虫和减卵效果,但是可以减轻小鼠肝脏病理损伤。(本文来源于《南京医科大学》期刊2016-05-01）
徐天华[5]（2016）在《重组日本血吸虫虫卵蛋白Sjp40诱导HSCs衰老的作用机制》一文中研究指出目的探索重组日本血吸虫虫卵蛋白Sjp40对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)衰老的影响和作用机制。方法(1)使用不同浓度的Sjp40(5,10,20,40μg/mL)处理人肝星状细胞株LX-2细胞48小时后,运用Western Blot法检测HSCs肝纤维化标志分子的表达情况并确定最适宜的刺激浓度;(2)Sjp40刺激LX-2细胞后,使用Western Blot法检测裂解的Caspase-3表达水平、SA-β-Gal染色检测LX-2细胞的衰老以及MTT法检测细胞的增殖能力(OVA、ETO分别为阴性对照和阳性对照);(3)Sjp40刺激LX-2细胞后,应用流式细胞术检测细胞周期,用Western Blot法分析与G1-S转化相关的细胞周期调节蛋白的变化;(4)Sjp40刺激LX-2细胞后运用Western Blot法检测p53、P-p53、p21、p16的表达情况,运用p53干扰质粒敲降p53基因的表达,使用SA-β-Gal染色检测细胞衰老,用Western Blot法检测敲降p53后p53,P-p53,p21的表达情况(实验分组:Control,Sjp40,Sh-Con,Sh-Con+Sjp40,Sh-p53,Sh-p53+Sjp40,OVA);(5)Sjp40刺激LX-2细胞后,实验运用Western Blot法检测STAT3和P-STAT3的表达情况。利用免疫荧光染色法观察Sjp40对STAT3核转移的作用;(6)运用STAT3干扰RNA敲降STAT3基因的表达,使用SA-β-Gal染色检测细胞衰老,用Western Blot法检测敲降STAT3后STAT3,P-STAT3,P-p53,p21的表达情况(干扰实验分组:Control,Sjp40,Si-Con,Si-Con+Sjp40,Si-STAT3,Si-STAT3+Sjp40,OVA);(7)通过LPS刺激LX-2细胞,增强TLR-4的表达。检测TLR-4蛋白水平增加后对Sjp40诱导的细胞衰老以及对衰老关键分子p-p53的影响(实验分组:control,sjp40,lps,lps+sjp40,ova);(8)sjp40刺激lx-2细胞后,westernblot法检测p27、p-rb、p-erk和skp2等衰老及细胞周期相关分子的表达情况并运用p27小干扰rna(si-p27)敲降p27基因的表达,westernblot法检测敲降p27后p27及skp2的表达情况、sa-β-gal染色检测p27敲降后细胞衰老的变化(干扰实验分组:control,sjp40,si-con,si-con+sjp40,si-p27,si-p27+sjp40,ova);(9)skp2过表达质粒转染lx-2细胞后,使用sa-β-gal染色检测skp2过表达后细胞衰老的变化、westernblot法检测skp2过表达后p27及hscs肝纤维化标志分子的表达(过表达实验分组:control,sjp40,pcdna3.1,pcdna3.1+sjp40,pcdna3.1-skp2,pcdna3.1-skp2+sjp40,ova);(10)sjp40刺激lx-2细胞后,运用westernblot法检测细胞内黏附分子以及nk细胞受体的配体分子的表达情况,同时用细胞荧光技术对共培养的人nk细胞株yt和lx-2细胞进行共定位以及细胞毒性试验检测yt细胞对衰老lx-2的清除作用。结果(1)westernblot结果显示sjp40处理lx-2细胞后能够下调肝纤维化相关蛋白α-sma和collagentypei的表达;(2)sjp40处理lx-2细胞后sa-β-gal染色阳性的细胞数增多,表明sjp40能够诱导lx-2细胞衰老。mtt法结果进一步证实sjp40能够抑制细胞增殖。流式细胞术检测结果表明sjp40能够导致lx-2细胞发生g1期细胞周期停滞,同时,westernblot结果显示sjp40能够引起g1-s转化相关的细胞周期调节蛋白的变化,抑制p-rb和cyclina表达;(3)sjp40能够上调p-stat3,p-p53和p21的表达,促进stat3的核转移。同时,敲降p53或stat3基因能够逆转sjp40诱导的细胞衰老;(4)sjp40能够抑制tlr-4表达。当lps刺激tlr-4表达增强后,衰老关键分子p-p53的表达显着降低,同时sa-β-gal染色阳性的细胞数明显下降;(5)sjp40通过上调p27及下调skp2的表达,活化skp2/p27信号通路。当敲降p27或过表达skp2后,sjp40所诱导的细胞衰老现象明显改善;(6)sjp40作用于lx-2细胞后,能够明显地上调细胞间黏附分子icam-1和nk细胞受体的配体分子mica的表达。同时,nk细胞通过细胞间直接接触的方式清除衰老的hscs。结论(1)sjp40可诱导hscs衰老;(2)sjp40通过stat3/p53/p21信号通路诱导hscs衰老;(3)sjp40还可通过skp2/p27信号通路诱导细胞的衰老;(4)衰老的HSCs可通过NK细胞以直接接触的方式加以清除。(本文来源于《南通大学》期刊2016-03-18）
彭文霞[6]（2016）在《重组日本血吸虫蛋白T2核糖核酸酶及SjE16对肝星状细胞活化的抑制作用》一文中研究指出目的探索重组日本血吸虫蛋白T2核糖核酸酶(rT2 RNase)和E16(rSjE16)对肝星状细胞(HSCs)活化的影响。方法1.利用重组蛋白rT2 RNase处理人肝星状细胞株LX-2细胞,应用Western Blot检测HSCs活化标志性分子a-SMA的表达,以及信号转导分子Smad4和NF-КB的表达。2.提取日本血吸虫虫卵总RNA并逆转录为cDNA,根据已获得的日本血吸虫SjE16基因序列(GenBank:FN320650.1)设计引物,通过原核表达系统诱导表达纯化获得重组蛋白rSjE16。用重组蛋白rSjE16处理LX-2细胞,通过MTT实验检测rSjE16对LX-2细胞增殖的影响;通过流式细胞术用检测rSjE16对LX-2细胞周期的影响以及用Western Blot检测其对活化的HSCs中纤维化相关基因的影响;通过qRT-PCR观察rSjE16对肝星状细胞中炎症因子表达水平的影响。结果1.人肝星状细胞株LX-2经不同浓度重组蛋白rT2 RNase处理不同间后,LX-2中α-SMA表达显着下调,同时,重组蛋白rT2 RNase能够诱导LX-2细胞中PPARγ的表达增加。当TGF-β1与rT2 RNase共同处理LX-2细胞后,rT2 RNase能下调Smad4的水平进而抑制TGF-β1诱导的α-SMA表达。此外,重组T2 RNase可以抑制NF-КB以及p-IКBα的表达。2.成功获得纯度较高的rSjE16重组蛋白。LX-2细胞经重组蛋白rSjE16处理后,α-SMA和胶原的表达显着下降,而PPARγ、MMP2以及MMP9的表达上调。同时,炎症因子IL-6和IL-8 mRNA水平也显着上升。然而rSjE16对LX-2细胞的增殖和细胞周期的作用不明显。结论1.rT2 RNase重组蛋白能够抑制肝星状细胞的活化,可能TGF-β1信号及NF-КB信号通路相关。2.rSjE16重组蛋白能够通过调节纤维化相关基因的表达抑制肝星状细胞的活化,并促进肝星状细胞中相关炎症因子的表达。(本文来源于《南通大学》期刊2016-03-18）
王书书[7]（2016）在《日本血吸虫重组蛋白Cystatin保护小鼠结肠炎及其免疫调节机制研究》一文中研究指出背景：炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一种慢性且易复发的肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)和克隆氏病(Crohn's disease, CD),具体发病因素尚不明确。目前认为IBD是由综合性因素导致,包括环境因素,免疫紊乱,肠道粘膜屏障功能破坏以及肠腔内菌群失调等,这些因素触发了先天免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞介导的免疫应答,产生一氧化氮(NO),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子和介质,进一步启动适应性免疫应答,产生大量前炎症因子IL-17A、IFNγ等,最终导致肠道的强烈炎症反应。近年来由于发达国家卫生条件不断改善已接近高度清洁水平,很多寄生于肠道的蠕虫被彻底清除,但自身免疫性疾病的发生率却逐年增加,这种趋势也逐渐蔓延至发展中国家及欠发达地区。这一现象可以用“卫生假说”理论很好解释,基于这一理论,许多学者研究发现预先感染蠕虫或采用蠕虫来源的某些具有免疫调节作用的蛋白干预炎症性肠病小鼠模型,发现具有抑制小鼠肠道炎症的作用。有研究表明预先感染Heligmosomoides polygyrus对2,4,6-叁硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎小鼠具有肯定的保护作用；预先感染Trichinella spiralis或是用幼虫抗原治疗DNBS诱导的肠炎发现也是同样有保护作用。另有学者研究发现予曼氏血吸虫的虫卵或可溶性蛋白干预结肠炎小鼠,通过降低前炎症因子IFNγ、IL-17A的mRNA表达,促进抗炎因子IL-4mRNA的表达从而减轻小鼠结肠炎。但是若予以活虫或虫卵给予患者口服,会存在较大风险,一般不易被患者接受,因此研究者们将目光转向了蠕虫来源的相关蛋白,虫体的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)就是其中一种被证实具有调节宿主免疫功能的蛋白。半胱氨酸蛋白酶抑制剂,简称胱抑素,是一类广泛存在于生物体内的包括存在于各种蠕虫体内的半胱氨酸蛋白酶高效抑制剂,构成一个半胱氨酸酶抑制剂的大家族,依据氨基酸序列被分为3大家族,即stefins(家族1),cystatins(家族2)和kininogens(家族3)。属于家族1(stefins)的日本血吸虫cystatin基因组DNA和cDNA的全长序列在基因库里分别编号为FJ617451和FJ617450, cDNA的全长基因序列的开放阅读框长度为306bp,编码101个氨基酸,理论分子量为11.3kDa。属于家族2的日本血吸虫的cystatin近年已被体外实验证实通过抑制活化的RAW264.7的LPS诱导产生的TNF-α和IL-6对巨噬细胞的偏移有调节作用。对于日本血吸虫和曼氏血吸虫感染宿主诱导的负向免疫调控研究已深入到虫源性分子的水平,但是日本血吸虫半胱氨酸酶抑制剂相关的体内实验尚未见报道。因此设计本课题拟观察rSjcysatin对TNBS诱导的结肠炎小鼠的保护作用及探索负向免疫调节机制。目的：观察日本血吸虫的cystatin(家族1)对TNBS诱导的小鼠结肠炎的保护作用。通过分析比较各组小鼠结肠炎的炎症指标的变化,以及小鼠脾脏、肠系膜淋巴结、结肠固有层单个核细胞的CD4+T淋巴细胞的Th1、Th2、Th17、Treg的比例变化来探讨日本血吸虫cystatin对结肠炎小鼠的保护作用,并探索rSjcystatin负向免疫调节机制,为治疗IBD提供一个可靠的理论依据,从而避免临床上运用感染蠕虫来调节患者免疫失衡治疗IBD。方法：将pET-28A-Sj cystatin质粒转化到大肠杆菌BL21,37 ℃, 1mM IPTG诱导表达重组蛋白后经超声破菌、镍柱纯化,BCA法测定纯化蛋白质浓度-80℃保存或直接稀释后注射小鼠。60只8周雌性Balb/C小鼠随机分为6组,每组10只,分别为：①rSjcystatin治疗组：造模后6 h和24 h腹腔注射rSjcystatin 50 μg; ② rSjcystatin提前干预组：造模前腹腔注射rSjcystatin50 μg共3次,每次间隔5天,在最后一次注射蛋白的一周后予以TNBS灌肠造模；③结肠炎模型组：TNBS灌肠造模；④ rSjcystatin提前干预对照组：造模前腹腔注射rSjcystatin50μg共3次,每次间隔5天,在最后一次注射蛋白的一周后予以PBS灌肠；⑤ rSjcystatin治疗对照组：PBS灌肠后6 h和24h腹腔注射rSjcystatin 50 μg;⑥正常对照组：PBS对照组。所有试验动物造模3天后无痛处死,结肠病变进行炎症评分5方面包括疾病症状评分(DAI)、结肠长度变化、结肠病变程度(MAO)、病理分级(MIO)、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性测定,并提取脾、肠系膜淋巴结及结肠粘膜固有层淋巴细胞,流式检测Thl(IFN-γ)> Th2(IL-4)、 Th17(IL-17A)及Treg比例；qRT-PCR则定上述细胞因子的mRNA表达,ELISA测定结肠组织匀浆上清中相关因子的水平,Western blot测定结肠匀浆中Th1 (T-bet)、Th2 (GATA-3)、Th17 (RORyt)及Treg (Foxp3)重要转录因子的蛋白表达。结果：(1)TNBS结肠炎模型小鼠第1天出现程度不同的稀便、黏液血便或血便,并伴有显着的体重下降；rSjcystatin治疗组小鼠DAI、MAO、MIO、MPO均明显低于结肠炎小鼠；而rSjcystatin预防组小鼠结肠炎症指标与结肠炎组小鼠相比无差异(p＞0.05)；(2)实验小鼠病变局部和脾脏细胞因子变化：①脾脏淋巴细胞：TNBS诱导结肠炎组小鼠脾脏CD4+IFNγ+、CD4+IL-17A+占CD4+T比例分别为(2.92±0.54)%和(2.27±0.53)%,与正常小鼠CD4+IFNγ+(1.28±0.29)%、CD4+IL-17A+(0.90±0.09)%相比显着增加(p<0.05); rSjcystatin治疗组小鼠的脾淋巴细胞CD4+IFNγ+比例下降为(1.55+0.20)%,与炎症组小鼠相比,有统计学意义；CD4+IL-17A+比例为(1.75±0.49)%,IL-17A mRNA表达水平(2.70±1.35)较炎症组小鼠(3.63+1.80)减少,但无统计学差异；各组间脾脏淋巴细胞Treg、CD4+IL-4+占CD4+T比例、Foxp3、IL-10和TGF-β的mRNA表达水平均无统计学差异； ②肠系膜淋巴结(MLN):rSjcystatin治疗组小鼠MLN中CD4+IFNy+比例为(3.11±0.51)%,与结肠炎组小鼠(4.61±1.02)%相比明显降低(p<0.05)；MLN中Treg比例(9.82±0.85)%明显高于炎症组(4.39±1.38)%和正常组小鼠(1.28±0.29)%; Foxp3. IL-10和TGF-p mRNA表达增加(球0.05)：③结肠固有层淋巴细胞(LPMC):rSjcystatin治疗组小鼠CD4+IFNy+占CD4+T比例(2.94±1.04)%与炎症组CD4+IFNy+比例(8.23±0.90)%相比明显减少(p＜0.05)；rSjcystatin治疗组CD4+CD25-Foxp3+T比例(5.25±1.51)%明显高于炎症组小鼠LPMC(1.78±0.41)% (p<0.05);治疗组小鼠MLN和LPMC的CD4+IL-4+与CD4+IL-17A+占CD4+T比例、IL-4mRNA和IL-17A mRNA与炎症组小鼠相比无统计学差异；(3)结肠匀浆上清中各因子水平：rSjcystatin治疗组小鼠结肠匀浆上清中IFNy (1126.8±230.16)pg/ml较炎症组(1628.6±358.51)pg/ml明显下降,IL-4(159.95±30.66) pg/ml, IL-13 (8623.1±1644.19) pg/ml, IL-10 (455.51±187.87) pg/ml, TGF-β (116.18±17.68) pg/ml均较炎症组明显上升；(4) Western blot检测结肠相关转录因子表达：rSjcystatin治疗组的Thl转录因子T-bet表达明显低于炎症组小鼠,而Th2转录因子GATA-3和Treg转录因子Foxp3表达明显增加,但Th17转录因子RORyt在炎症组和治疗组小鼠表达无明显差异。结论：TNBS诱导的结肠炎小鼠提前给予日本血吸虫重组rSjcystatin未见显着的预防作用：但是造模后给药能显着减轻TNBS诱导的小鼠结肠炎的病理损伤。其免疫调节机制可能是rSjcystatin下调了结肠炎小鼠的Thl优势应答,上调了肠系膜淋巴结和肠道调节性T细胞及肠道局部Th2反应。rSjcystatin具有减轻炎症性肠病病理损伤和下调Th1应答的作用,对于其潜在的治疗炎症性肠病的价值尚待深入研究。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2016-03-01）
王书书,谢园园,闫珂,沈继龙[8]（2015）在《日本血吸虫重组蛋白Cystatin保护小鼠结肠炎及其机制研究》一文中研究指出目的探讨日本血吸虫重组蛋白(r Sjcystatin)对TNBS诱导的小鼠结肠炎的保护作用及其负向免疫调节机制。材料与方法 60只8周雌性BALB/c小鼠随机分为6组,每组10只,分别为:正常对照组、结肠炎模型组、r Sjcystatin提前干预组、r Sjcystatin治疗组、r Sjcystatin提前干预对照组,及r Sjcystatin治疗对照组。小鼠轻度麻醉后,软管从肛门插入结肠4cm处,实验组小鼠注入乙醇稀释的TNBS0.1ml;正常组及干预对照组、治疗对照组以等体积生理盐水灌肠。提前干预组及相应对照组分别于造模前腹腔注射r Sjcystatin50μg共3次,每次间隔5天;治疗组及相应对照组分别于造模后6h和24h腹腔注射r Sjcystatin 50μg。造模3天后无痛处死小鼠,结肠病变进行炎症评分包括疾病症状评分(DAI)、结肠病变程度、病理分级、结肠组织髓过氧化物酶测定,并提取脾、肠系膜淋巴结及结肠粘膜固有层淋巴细胞,流式检测Th1(IFN-γ)、Th2(IL-4)、Th17(IL-17A)及Treg比例;q RT-PCR测定上述细胞因子的m RNA表达。结果 1、TNBS结肠炎模型小鼠第1天出现程度不同的稀便、黏液血便或血便,并伴有显着的体重下降;r Sjcystatin治疗组小鼠DAI、结肠病变程度评分及病理分级评分、MPO均明显低于结肠炎小鼠;而r Sjcystatin预防组小鼠结肠炎症指标与结肠炎模型组相比无差异(P>0.05);2、实验小鼠病变局部和脾脏细胞因子变化:1脾脏淋巴细胞:TNBS诱导的结肠炎组小鼠脾脏CD4~+IFNγ~+、CD4~+IL-17A~+占CD4~+比例分别为(2.92±0.54)%和(2.27±0.53)%,与正常小鼠相比显着增加(P<0.05);r Sjcystatin治疗组小鼠的脾淋巴细胞CD4~+IFNγ~+和CD4~+IL-17A~+比例下降,分别为(1.55±0.20)%和(1.75±0.49)%,且IL-17A m RNA表达水平(0.16±0.1)%较造模组有下调趋势,但未达到统计学差异;各组间脾脏淋巴细胞Treg、CD4~+IL-4~+占CD4~+比例、IL-10和TGF-β的m RNA表达水平均无统计学差异;2肠系膜淋巴结淋巴细胞(MLN):r Sjcystatin治疗组小鼠MLN中CD4~+IFNγ~+比例为(3.11±0.51)%,与造模组小鼠(4.00±0.85)%相比有所下降;治疗组MLN中Treg比例(9.82±0.85)%明显高于未治疗组(4.39±1.38)%和正常组小鼠(4.71±0.47)%,P<0.05;Foxp3 m RNA、TGF-βm RNA、IL-10m RNA表达较未治疗组增加(P<0.05);3结肠固有层淋巴细胞(LPMC):r Sjcystatin治疗组小鼠CD4~+IFNγ~+占CD4比例(2.77±0.80)%与未治疗组CD4~+IFN~+比例(8.23±0.90)%相比明显减少(P<0.05);r Sjcystatin治疗组LPMC的CD4~+CD25-Foxp3~+比例(5.25±1.51)%明显高于正常组(3.05±0.99)%和未治疗组(1.78±0.41)%,P<0.05。3、ELISA检测结肠组织匀浆上清中各因子水平:结肠炎未治疗组IFNγ(1628.6±358.81)pg/ml、IL-17水平(8214.4±2731.49)pg/ml相比正常对照组IFNγ(433.0±166.77)pg/ml、IL-17(1475.3±844.57)pg/ml显着升高(p<0.05);结肠炎治疗组IFNγ(1126.8±230.16)pg/ml明显下降、IL-4(159.95±30.66)pg/ml、IL-10(455.51±187.87)pg/ml、IL-13(8623.1±1644.19)pg/ml、TGF-β(116.18±17.68)pg/ml均较未治疗组显着升高(p<0.05)。结论 TNBS诱导的结肠炎小鼠提前给予日本血吸虫重组r Sjcystatin未见显着的预防作用;但是造模后给药能显着减轻TNBS诱导的小鼠结肠炎的病理损伤。其免疫调节机制可能是r Sjcystatin一定程度上下调结肠炎小鼠的Th1优势应答,在炎症局部可诱导Th2应答,同时上调肠系膜淋巴结和肠道调节性T细胞。r Sjcystatin具有减轻炎症性肠病病理损伤作用,对于其潜在的治疗炎症性肠病的价值尚待深入研究。(本文来源于《中国动物学会寄生虫学专业委员会第十五次全国学术会议暨第六次国际寄生虫学学术研讨会论文摘要集》期刊2015-08-12）
刘艳涛,洪炀,张旻,韩倩,曹晓丹[9]（2015）在《日本血吸虫SjOST48基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫保护效果分析》一文中研究指出为了鉴定日本血吸虫SJCHGC01743基因并评估其重组蛋白作为新的血吸虫病候选疫苗抗原的潜力,利用PCR技术扩增日本血吸虫SJCHGC01743基因,应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的转录水平,以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并诱导其在大肠杆菌中表达。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,利用Western blotting检测重组蛋白的免疫原性,应用间接免疫荧光技术对SJCHGC01743进行蛋白组织定位,利用间接ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体水平。将重组抗原免疫小鼠,评估其免疫保护效果。PCR扩增得到1 248 bp不含信号肽的c DNA序列,同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫寡糖转移酶OST48亚基,命名为Sj OST48。实时定量PCR分析显示Sj OST48在检测的童虫和成虫各个期别虫体中均有转录,其中在28 d虫体中的转录水平最高,在42 d雌虫中的转录量显着高于雄虫。构建的重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj OST48成功在大肠杆菌中表达,重组蛋白r Sj OST48分子量约50 k Da。Western blotting分析表明r Sj OST48能被小鼠免疫血清识别,具有良好的免疫原性,间接免疫荧光实验表明Sj OST48蛋白主要分布于虫体体被,少量分布于实质。ELISA检测结果表明r Sj OST48能诱导产生较高的特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体。动物免疫保护实验结果表明Sj OST48能诱导小鼠产生32.62%(P<0.05)的减虫率及57.61%(P<0.01)的肝脏减卵率。本研究为深入探讨日本血吸虫Sj OST48基因的生物学功能及筛选新的血吸虫疫苗候选分子奠定了基础。(本文来源于《生物工程学报》期刊2015年04期）
雷娜,刘淼,任翠平,刁玉洁,杨菲[10]（2014）在《日本血吸虫重组SjTsp2/Sj29ku蛋白疫苗对小鼠免疫效果的研究》一文中研究指出目的探讨日本血吸虫重组Tsp2/Sj29 ku表膜蛋白疫苗对小鼠的抗病免疫效果。方法 pet32a/SjTsp2/Sj29 ku重组菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,制备纯化的重组蛋白。29只6周龄雌性昆明鼠随机分为蛋白疫苗组、硫氧还蛋白组和空白对照组,前两组各10只,空白对照组9只。蛋白疫苗组,第一次免疫每鼠经背部皮下多点注射用等体积弗氏完全佐剂乳化的50μg SjTsp2/Sj29 ku重组表膜蛋白,第12、24天每鼠皮下多点再次注射用等体积弗氏不完全佐剂乳化的50μg该重组蛋白。硫氧还蛋白组的免疫方法同蛋白疫苗组。空白对照组用生理盐水代替蛋白,免疫方法同前。末次免疫后第10天,每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±2)条。于感染45 d后剖杀全部实验小鼠,计算减虫率和减卵率。眼眶取血,分离血清,间接性ELISA法检测IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗体亚型,同时检测血清细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白介素4(IL-4)水平。结果 pet32a/SjTsp2/Sj29 ku菌经IPTG诱导可大量表达,经变性、复性获得纯化的日本血吸虫Tsp2/Sj29 ku重组表膜蛋白。蛋白疫苗组与空白对照组比较,减虫率和减卵率显着升高(P<0.05)。硫氧还蛋白组与空白对照组之间比较,减虫率和减卵率差异均无统计学意义(P>0.05)。蛋白疫苗组小鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG2b显着高于空白对照组(P<0.05),而IgG3和IgM较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。蛋白疫苗组小鼠血清IFN-γ、IL-4细胞因子显着高于空白对照组(P<0.01)。结论日本血吸虫Tsp2/Sj29 ku重组表膜蛋白疫苗对小鼠抗感染有一定的保护性;该重组蛋白免疫引起的是Th1/Th2混合型免疫反应。(本文来源于《安徽医科大学学报》期刊2014年10期）
重组日血吸虫蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的探讨日本血吸虫可溶性成虫蛋白(SjSWP)和重组半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白(rSjcystatin)对模拟炎症性肠病的小鼠结肠炎的作用。方法 24只BALB/c雌鼠分为健康对照组、磷酸盐缓冲液组(PBS组)、rSjcystatin治疗组(rSjcystatin组)、 Sj SWP治疗组(SjSWP组)。PBS、 rSjcystatin、 SjSWP组用0.1 ml 5%2,4,6-叁硝基苯磺酸(TNBS)灌肠诱导结肠炎,灌肠后6、 24 h分别腹腔注射100μl PBS、 50μg r Sjcystatin、 50μg SjSWP;健康对照组在相应时间点用等量的PBS灌肠及腹腔注射。TNBS灌肠72 h后无痛处死各组小鼠,检测宏观评分、结肠长度、髓过氧化物酶活性和显微镜下微观评分来评估炎症参数和病理改变。流式细胞仪检测小鼠脾脏中Th1和Th2及T调节细胞(Tregs)的比例。ELISA检测小鼠结肠组织匀浆上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4 (IL-4)、 IL-13、 IL-10等炎性细胞因子的水平。多组计量资料分析采用单因素方差分析,多组均数间的两两比较用Student-Newman-Keuls检验。结果 TNBS诱导的结肠炎小鼠表现出明显的炎症和病理学特征,表现为体质量下降,便血、腹泻、结肠缩短、溃疡,以及炎性细胞因子IFN-γ、炎性细胞浸润和髓过氧化物酶活性的增加。与PBS组相比, rSjcystatin和SjSWP的干预治疗可以显着改善TNBS诱导的结肠炎症,表现为宏观评分(改善结肠糜烂、黏连、溃疡和缩短)和微观评分(减少组织损伤和炎症)的降低。健康对照组、 PBS组、 rSjcystatin组和SjSWP组小鼠结肠的宏观评分分别为0、 9.8±0.8、 4.3±1.0和4.5±1.4,微观评分分别为0、 6.0±0.4、 2.2±0.5和2.8±0.6,rSjcystatin组、 SjSWP组与PBS组相比差异均有统计学意义(F=57.8、 34.1, P <0.01), rSjcystatin组与SjSWP组间差异均无统计学意义(P> 0.05)。健康对照组、 PBS组、 rSjcystatin组和SjSWP组髓过氧化物酶分别为0.3±0.0、 1.4±0.1、 0.6±0.1和0.6±0.1 (F=32.5, P <0.01);脾脏Tregs比例分别为(4.4±0.7)%、(8.2±3.1)%、(18.4±2.1)%和(13.4±1.9)%(F=8.3, P <0.01);结肠组织匀浆上清中IFN-γ、 IL-10水平分别为(952.0±61.1)、(1 684.6±158.3)、(1 092.0±81.9)、(1 001.6±111.2) pg/ml,(322.8±27.4)、(399.3±77.9)、(860.6±153.6)、(892.0±113.8) pg/ml (F=9.6、 8.3, P <0.05);与PBS组相比, rSjcystatin与SjSWP组的INF-γ、髓过氧化物酶活性明显减低, Tregs应答增强, IL-10分泌增多,差异均有统计学意义(P <0.01), rSjcystatin组与SjSWP组间差异均无统计学意义(P> 0.05)。结论 SjSWP及rSjcystatin均可通过上调小鼠Treg和Th2介导的免疫应答,减轻小鼠实验性结肠炎,抑制导致结肠炎发病的Th1免疫应答。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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