西瓜噬酸菌miaA、hflX基因功能及sRNA研究

论文摘要

瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch,BFB）,是世界范围内的细菌性检疫病害,通过种传严重为害如西瓜、甜瓜等葫芦科作物,在世界各国的西、甜瓜产区普遍发生,并造成严重的经济损失。BFB的病原菌为西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）,革兰氏染色阴性,单根极生鞭毛,最适生长温度2428℃,能够通过III型分泌系统（TypeⅢsecretion system,T3SS）将效应子（effector）直接注入到宿主细胞体内。目前,仍没有针对BFB的商品化的抗病品种。转录后水平的调控对于基因的表达、蛋白的正常装配、生命活动的维持具有重要意义。Hfq为RNA伴侣蛋白,能够同小型非编码RNA（small non-coding RNA,sRNA）一起对基因转录后水平做出调控,促进或抑制靶标mRNA的翻译。而MiaA是tRNA异戊烯焦磷酸转移酶,能够在促进翻译保真度方面发挥关键作用。此外,翻译阶段为了合成有效的多肽,需要额外的核糖体相关蛋白,HflX便是其中之一。编码HflX的基因位于hfq基因下游,能够编码GTP结合蛋白,利用GTP的水解可以驱动其他相关蛋白的功能循环。本实验通过对hfq、miaA、hflX基因进行生物信息学分析,了解了其在西瓜噬酸菌中的基因信息,为了研究基因的功能,通过三亲及同源重组交换构建了miaA、hflX基因的缺失突变菌株,并进行了基因的回补,获得了互补菌株,同野生菌株Aac5进行了各项表型的测定,并利用qRT-PCR测定了hfq、miaA、hflX三者之间可能存在的调控关系。此外,利用生物信息学预测及构建hfq过表达菌株,检测了西瓜噬酸菌中可能存在的Hfq依赖性sRNA,对其在压力环境下的表达量测定之后,选取候选sRNA NC-27在基因组中对其进行了敲除及回补,研究了其在西瓜噬酸菌中的功能并对其靶标mRNA做出了预测。结果如下:（1）通过生物信息学分析发现,西瓜噬酸菌中hfq基因所编码的Hfq蛋白含83个氨基酸,无特殊结构域,能够作为RNA伴侣蛋白行使功能;MiaA蛋白由350个氨基酸组成,具有两个低复杂度域和一个IPPT结构域,它可以催化反密码子附近腺苷的修饰;HflX由390个氨基酸组成,具有两个GTP结合结构域和一个FeoB结构域。通过蛋白互作关系的预测后发现,Hfq、MiaA、HflX三者可能存在互作关系。（2）miaA、hflX的缺失均降低了西瓜噬酸菌对寄主的致病能力。miaA的缺失,使得西瓜噬酸菌Aac5的三型分泌系统关键基因hrpX显著下调,致病力及生物膜形成能力显著下降,褐色素分泌增多,但未影响其引起烟草过敏性反应的能力。而hflX基因的缺失,同样未对西瓜噬酸菌Aac5菌株引起烟草过敏性反应的能力产生影响。尽管表现出了更强的生物膜形成能力,但是运动能力却显著下降,同时,三型分泌系统关键基因hrpG、hrpE显著下调,其致病能力也显著下降。（3）miaA、hflX同hfq之间存在调控关系。经qRT-PCR测定后发现,hfq基因受到hflX、miaA基因正向调控,hflX基因受到miaA基因正向调控,miaA基因受到hflX基因负向调控。（4）在西瓜噬酸菌中预测到了31个sRNA,其中6个候选sRNA的稳定性依赖于Hfq蛋白。使用SIPHT在西瓜噬酸菌AAC00-1中预测到了31个潜在的sRNA,使用hfq过表达菌株的cDNA进行real-time PCR后发现,其中有6个sRNA的表达量显著上调,即这些sRNA的稳定性依赖于Hfq蛋白。在不同压力环境下,候选sRNA的表达量有所不同。（5）候选sRNA NC-27的缺失,增加了西瓜噬酸菌Aac5的致病能力。NC-27的缺失,增加了hrpG mRNA积累,致使T3SS蛋白HrpG增多,而作为hrpX的上游调控因子,其增多也导致了hrpX mRNA乃至HrpX的上调表达,同时,装置蛋白HrcJ也大量增加,使得其致病力增强。（6）使用Target RNA2在西瓜噬酸菌中共预测到了候选sRNA NC-27的29个靶mRNA,通过对NC-27的二级结构分析后发现,其在3’端具有一段富含尿嘧啶（U）的序列,能够同Hfq蛋白内圈氨基酸接触,而同候选靶mRNA的结合位点主要位于102117核酸之间。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
•   1.1 瓜类细菌性果斑病及其病原菌简介
•     1.1.1 瓜类细菌性果斑病
•     1.1.2 病原菌西瓜噬酸菌
•     1.1.3 细菌III型分泌系统
•     1.1.4 西瓜噬酸菌的检测鉴定
•     1.1.5 瓜类细菌性果斑病的防治方法
•   1.2 sRNA及 Hfq蛋白概述
•     1.2.1 sRNA概述
•     1.2.2 RNA伴侣蛋白Hfq
•   1.3 MiaA、HflX蛋白简介
•     1.3.1 MiaA简介
•     1.3.2 HflX简介
•   1.4 研究内容、目的及意义
•     1.4.1 研究内容
•     1.4.2 研究目的及意义
•   1.5 技术路线
• 第二章 西瓜噬酸菌hfq、miaA、hflX生物信息学分析
•   2.1 实验材料
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 西瓜噬酸菌hfq、miaA和 hflX基本信息
•     2.2.2 西瓜噬酸菌Hfq、MiaA和 HflX结构域预测
•     2.2.3 西瓜噬酸菌Hfq、MiaA和 HflX系统发育树构建
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 西瓜噬酸菌hfq生物信息学分析
•     2.3.2 西瓜噬酸菌miaA生物信息学分析
•     2.3.3 西瓜噬酸菌hfl X生物信息学分析
•   2.4 小结与讨论
• 第三章 西瓜噬酸菌miaA、hflX突变株构建及功能分析
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验菌株及质粒
•     3.1.2 主要仪器及设备
•     3.1.3 试剂及抗生素
•     3.1.4 所用培养基
•     3.1.5 植物材料
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 PCR及荧光定量引物设计
•     3.2.2 构建突变株ΔmiaA及 ΔhflX
•     3.2.3 互补菌株的构建及筛选
•     3.2.4 供试菌株总RNA的提取及反转录
•     3.2.5 致病性及T3SS相关基因表达量测定
•     3.2.6 烟草过敏性反应测定
•     3.2.7 运动能力及鞭毛相关基因表达量测定
•     3.2.8 生物膜形成能力测定
•     3.2.9 体外生长能力测定
•     3.2.10 基因关系测定
•     3.2.11 数据分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 构建自杀性重组载体和互补载体
•     3.3.2 突变株及互补菌株筛选
•     3.3.3 致病性及T3SS相关基因表达量测定结果
•     3.3.4 烟草过敏性反应测定结果
•     3.3.5 运动能力及编码鞭毛的基因表达量测定结果
•     3.3.6 生物膜形成能力测定结果
•     3.3.7 生长能力测定结果
•     3.3.8 基因关系测定结果
•     3.3.9 色素基因表达量测定结果
•   3.4 小结与讨论
• 第四章 西瓜噬酸菌中s RNA的预测
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 预测所需工具及菌株
•     4.1.2 实验菌株及质粒
•     4.1.3 主要仪器及设备
•     4.1.4 试剂及抗生素
•     4.1.5 所用培养基
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 西瓜噬酸菌sRNA的预测
•     4.2.2 hfq过表达菌株的构建
•     4.2.3 供试菌株在压力环境下的培养
•     4.2.4 荧光定量引物设计
•     4.2.5 供试菌株总RNA提取及反转录
•     4.2.6 荧光定量PCR反应及数据分析
•     4.2.7 数据分析
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 西瓜噬酸菌AAC00-1 中预测到了31个sRNA
•     4.3.2 hfq过表达菌株的筛选
•     4.3.3 部分预测到的s RNA在 hfq过表达菌株中的表达量分析
•     4.3.4 hfq及部分预测的s RNA在压力环境下的表达量分析
•   4.4 小结与讨论
• 第五章 候选s RNA NC-27 功能分析
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 实验菌株及质粒
•     5.1.2 主要仪器及设备
•     5.1.3 试剂及抗生素
•     5.1.4 所用培养基
•     5.1.5 植物材料
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 PCR及荧光定量引物设计
•     5.2.2 构建突变株ΔNC-27
•     5.2.3 互补菌株的构建及筛选
•     5.2.4 供试菌株总RNA的提取及反转录
•     5.2.5 致病性测定
•     5.2.6 烟草过敏性反应测定
•     5.2.7 Western blot及 T3SS相关基因表达量测定
•     5.2.8 运动能力的测定
•     5.2.9 生物膜形成能力测定
•     5.2.10 生长能力测定
•     5.2.11 NC-27 靶标的预测
•     5.2.12 预测的靶标在ΔNC-27 相对野生菌株表达量的测定
•     5.2.13 候选s RNA NC-27 二级结构的预测
•     5.2.14 数据分析
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 构建自杀性重组载体和互补载体
•     5.3.2 突变株及互补菌株筛选
•     5.3.3 致病性测定结果
•     5.3.4 烟草过敏性反应测定结果
•     5.3.5 HrpG、Hrp X表达量及III型分泌系统基因表达量测定结果
•     5.3.6 运动能力测定结果
•     5.3.7 生物膜形成能力测定结果
•     5.3.8 生长能力测定结果
•     5.3.9 NC-27 靶标预测结果
•     5.3.10 预测到的NC-27 靶标的表达量测定结果
•     5.3.11 NC-27 的二级结构及功能序列
•   5.4 小结与讨论
• 第六章 全文结论及展望
•   6.1 miaA、hflX同 hfq之间存在调控关系
•   6.2 miaA基因的缺失,降低了Aac5 菌株的致病能力
•   6.3 hflX基因的缺失,降低了Aac5 菌株的致病能力
•   6.4 在西瓜噬酸菌中预测到了31个s RNA,其中6个s RNA的稳定性依赖于Hfq蛋白
•   6.5 NC-27 的缺失,增强了Aac5 菌株的致病能力
•   6.6 预测到了NC-27的29 个靶蛋白
•   6.7 展望
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 乔培

导师: 赵廷昌

关键词: 西瓜噬酸菌,致病力

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 吉林农业大学

分类号: S432.42

总页数: 85

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