一、致绵羊脑炎单核细胞增多症李氏杆菌的分离与鉴定（论文文献综述）
曹启航[1]（2021）在《单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成过程的转录组学分析》文中进行了进一步梳理单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）简称单增李斯特菌,能穿越人和动物机体的三大屏障,引起胃肠炎、脑膜炎、流产、败血症等,所致疾病呈全球性分布且发病数逐年升高,是重要的人兽共患病和食源性疾病的病原菌。生物被膜（Biofilm,BF）是一种细菌胞外聚合物,因其特殊的立体多层结构,导致细菌耐药性增强、多种细菌协同共生,进一步污染食品加工环境以及食品,严重危害人类健康,影响公共卫生安全和养殖业发展。转录水平的研究,有助于发现BF形成对LM基因表达的影响,并揭示该菌BF形成过程中的调控机制。基于此,本论文完成了以下研究工作:（1）以单增李斯特菌为研究对象,利用试管培养法、载玻片培养法和微孔板定量法,测定不同培养条件下该菌生物被膜的形成情况,并对其形成条件进行了优化。结果显示:在体外制备BF菌过程中,培养6 h～24 h有少量细菌附着和微菌落形成,24 h后出现成熟致密的BF,微菌落连成网状结构,48 h～72 h生物被膜聚集叠加,形成复杂的团状结构;单增李斯特菌BF形成的最适培养基浓度、温度、p H、Na Cl浓度和葡萄糖浓度分别为100%BHI培养基、37℃、7.5、5.0 g/L和22.0 g/L。（2）将不同形成时期的BF菌与浮游菌进行转录组测序分析,比较两种状态下基因的差异表达情况。结果显示:BF菌在12 h时,差异表达基因有1 588个,包括797个基因表达上调和791个基因表达下调;BF菌在24 h时,差异表达基因有1 517个,包括758个基因表达上调和759个基因表达下调;BF菌在48 h时,差异表达基因有1 462个,包括736个基因表达上调和726个基因表达下调;其中有1 123个基因在这3个时间段中均呈差异表达。（3）对筛选出的1 123个差异表达基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果发现:在GO功能注释中,主要有3个生物学过程（代谢、生物合成和翻译过程）、3个细胞组成（细胞器、蛋白复合物和细胞质）和4个分子功能（结构分子、连接酶、催化和转运活性）发生变化;在KEGG通路中,主要涉及磷酸转移酶系统（PTS）、鞭毛组装、不同环境中的微生物代谢、细菌趋化性、细菌分泌系统和群体感应（QS）等途径。（4）挑取部分差异表达基因进行实时荧光定量PCR和Northern blot验证。结果显示:实时荧光定量PCR所获得的基因表达差异倍数和Northern blot杂交结果与RNA-seq的趋势基本一致,表明转录组分析结果稳定可靠。综上所述,本研究证实了单增李斯特菌BF生长过程中的动态变化;优化了单增李斯特菌BF形成的最适条件;通过对不同形成时期的BF菌和浮游菌进行转录组测序分析,得到二者之间的差异表达基因,并对其进行富集分析;挑选了部分基因进行验证。本研究对单增李斯特菌BF在代谢、耐药和分泌等分子机制有了初步认识,对BF形成的调控机制有了深入了解,为有效控制BF的形成并寻找BF抑制剂提供科学依据。
任静静[2]（2020）在《单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株构建及炎性因子对小鼠血脑屏障损伤作用研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究以临床分离的致绵羊脑炎单增李斯特菌（Lm90）为材料,在inlA、inlB缺失基础上缺失inlJ构建三基因缺失株（Lm90-ΔinlABJ）,分析其部分生物学特性及对小鼠和绵羊的致病作用;应用Lm90感染小鼠,分析小鼠血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）通透性变化及发生损伤的可能作用机制,并构建体外BBB模型进一步验证炎性因子对小鼠BBB损伤的影响作用,为进一步研究单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,L.monocytogenes）的致病机理及防控李斯特菌病提供参考,也为进一步开展其它细菌性脑膜炎病原菌感染中枢神经系统的研究提供一定借鉴。方法:（1）用Primer 5.0软件设计引物,PCR扩增inlJ基因上、下游同源臂,采用重叠延伸PCR获得缺失inlJ的融合片段ΔinlJ;构建重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ,经电转化至Lm90-ΔinlAB感受态细胞,在温度及氯霉素双重压力下实现同源重组;筛选重组Lm90-ΔinlABJ,并检测其遗传稳定性。（2）采用细菌学方法对比分析Lm90-ΔinlABJ、Lm90-ΔinlAB及Lm90的生长特性、培养特性,并就细菌对细胞的侵袭能力和动物致病力等差异进行分析。（3）以致绵羊脑炎单增李斯特菌（Lm90）感染小鼠,通过临床症状观察、病理组织学检查、细菌回收等试验对小鼠感染模型进行评估,应用伊文思蓝法（Evan’s blue,EB）、蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）及免疫组化法分析小鼠感染后BBB通透性变化及紧密连接蛋白（Tight junctions,TJ）表达变化,并测定炎性因子水平,以探寻小鼠BBB损伤的可能作用机制。（4）原代分离培养新生小鼠脑微血管内皮细胞（Mouse brain microvascular endothelial cells,MBMEC）及星型胶质细胞（Astrocyte cells,AC）,并经形态学及免疫荧光鉴定;后应用共培养技术建立小鼠体外BBB模型,通过液面试漏实验、跨内皮细胞电阻（Trans-endothelial electronic resistance,TEER）、辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase permeability,HRP）测定以及WB检测TJ表达变化对BBB模型进行评价。后利用感染Lm90的RAW264.7细胞产物及白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）模拟L.monocytogenes感染导致的体内炎性环境作用于体外BBB模型,应用TEER和HRP通透率测定试验验证炎性因子对体外BBB模型通透性的影响,通过qRT-PCR、WB及细胞免疫荧光,分析炎性因子对BMECs间紧密连接的影响,并与小鼠体内感染试验相互验证。结果:（1）成功构建了重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ,结合电转化及同源重组技术成功构建了可稳定遗传的inlJ基因缺失株Lm90-ΔinlABJ。（2）inlJ基因缺失不影响L.monocytogenes的生长速度,Lm90-ΔinlABJ体外培养与Lm90-ΔinlAB及Lm90均无差异;细胞感染试验表明Lm90-ΔinlABJ对MBMEC的黏附率和侵袭率分别为2.54%、0.22%,与Lm90相比差异具有统计学意义（P<0.05）;与Lm90-ΔinlAB相比,黏附率与侵袭率均无显着差异（P>0.05）;小鼠感染试验显示Lm90-ΔinlABJ的LD50较Lm90-ΔinlAB升高了0.3个对数数量级,较Lm90升高了1.6个对数数量级;载菌量测定试验表明感染72 h后Lm90-ΔinlABJ在肝和脾中的载菌量较Lm90-ΔinlAB分别下降0.57、0.26个对数数量级,相比Lm90则分别下降1.02、0.96个对数数量级,表明缺失株毒力下降。绵羊感染试验表明Lm90-ΔinlABJ依然具有致病力,可引起绵羊脑炎。（3）Lm90在小鼠脑中定殖具有时间依赖性,感染后EB法测定结果提示感染初期小鼠BBB通透性未发生明显变化,当小鼠严重发病、濒临死亡时通透性显着增加;WB和免疫组化显示Lm90感染可下调Occludin和Claudin-5表达来增加BBB通透性;ELISA测定结果表明小鼠感染后,脑匀浆及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达上调,结合小鼠BBB通透性的变化,推测小鼠感染后BBB表现损伤,通透性增加,可能是炎性因子上调表达导致了紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5下调表达。（4）成功分离得到了小鼠原代BMECs及AC,形态学观察BMECs呈典型的铺路卵石样,AC有细长突触,胞质较浅,且二者经免疫荧光鉴定均正确。BMECs与AC共培养后,液面试漏实验为阳性;TEER值在72 h趋于稳定且在96 h达到403Ω·cm-2;HRP通透性测定结果与TEER结果具有一致性;WB检测显示细胞间紧密连接蛋白高表达;Lm90感染可诱导RAW264.7细胞炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达上调,且感染Lm90的RAW264.7产物及IL-1β均可下调BMECs紧密连接蛋白的表达而使BBB的通透性增加,体外试验结果与体内相符。结论:本研究成功构建了三基因缺失株Lm90-ΔinlABJ且遗传稳定性良好,生物学特性研究结果显示inlA、inlB、inlJ缺失对其生长无显着影响作用,缺失株对细胞的侵袭力及小鼠致病性明显下降,但仍有致病力,依然可导致绵羊脑炎;Lm90感染小鼠后,BBB通透性在感染初期无明显变化,在小鼠感染后期及濒临死亡时增加明显,且BBB表现出损伤作用,其可能机制是炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）上调表达,引起了紧密连接蛋白（Occludin、Cludin-5）下调表达,且体外试验结果进一步予以了证实。
熊静禹[3]（2020）在《产单核细胞李氏杆菌的临床分离与FlaA单克隆抗体的制备》文中提出产单核细胞李氏杆菌（Listeria Monocytogenes,LM）,为革兰氏阳性细菌,为胞内寄生菌。不但能感染动物,也可以感染人类引发公共卫生问题。为做好江苏省肉羊的健康养殖、肉羊源相关病原的风险评估,该研究对江苏主要养羊地区进行了产单核细胞李氏杆菌的临床检测,并研制了针对产单核细胞李氏杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体。通过PCR方法,对2017-2019年江苏主要养羊地区采集的1036份羊源肛拭子样品进行临床快速检测,确定2份（0.19%）样品为产单核细胞李氏杆菌阳性;该结果表明了产单核细胞李氏杆菌在江苏的肉羊养殖中为低频率感染,流行率较低。取2份PCR检测阳样品用特异性培养基PALCAM琼脂进行细菌分离,获得2株疑似产单核细胞李氏杆菌（分别命名为JC8株、JC46株）。通过对分离株的质谱鉴定、生化分析,确定JC8株、JC46株细菌均为产单核细胞李氏杆菌。利用多重PCR对分离株进行血清型鉴定,2株分离株血清型均属于1/2a或3a型。生物被膜形成能力试验显示JC46株有弱生物被膜形成能力,JC8株无生物被膜形成能力。为指导江苏地区产单核细胞李氏杆菌感染的抗生素用药,对JC8株与JC46株细菌进行了药敏实验,结果表明2株细菌均对链霉素、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、头孢拉定、林可霉素、罗红霉素以及阿奇霉素敏感,对多粘菌素和恩诺沙星耐药;JC8株对青霉素耐药,JC46株对青霉素敏感。FlaA为产单核细胞李氏杆菌的鞭毛蛋白,具有良好的抗原性,其抗体可用于该菌的检测。根据GenBank发布的FlaA基因（flaA）序列,设计1对特异性引物用于FlaA结构蛋白基因的扩增。使用PCR方法将其扩增并插入到pMD-18-T中进行克隆。经序列分析表明所扩增的FlaA结构蛋白基因与发表的序列一致。用BamH I与SamI将目的片段从pMD-18-T载体切出,并克隆至表达载体pGEX-6P-1;获得的质粒pGEX-6P-1-FlaA转化进大肠杆菌BL21（DE3）中。含有重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导表达后,在细菌裂解上清与沉淀中均表达,融合蛋白GST-FlaA（约55 kDa）。使用GST纯化柱纯化蛋白,用抗GST血清作为第一抗体,羊抗鼠IgG作为第二抗体进行Western-blot,结果显示融合蛋白可与抗GST血清发生反应。利用所得已纯化融合蛋白GST-FlaA作为免疫原,按照常规程序免疫6周龄BALB/c小鼠后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。通过间接ELISA筛选阳性细胞株,最终获得2株能够稳定分泌识别FlaA的单克隆抗体细胞株（3C4株和6F8株）。抗体亚类鉴定结果显示2株细胞产生的抗体亚类均为IgGl,轻链均为κ型。使用体内诱生法获得腹水,3C4株和6F8株细胞的腹水效价分别为1:256000、1:64000,且均能与FlaA包被抗原呈阳性反应,并与其他细菌无交叉反应。通过凝集试验,3C4株和6F8株单抗均能与产单核细胞李氏杆菌发生凝集反应。表明所制备的单抗可以用于产单核细胞李氏杆菌分离株的鉴定。
张奇文,凌晨,吴学林,马勋,薄新文[4]（2019）在《单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究》文中提出为了研究srtA基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA基因缺失株LM90SB2-?srt A,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-?srt A对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-?srt A感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srt A基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-?srt A对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显着统计学意义（p<0.05）;小鼠LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显着统计学意义（p<0.05）。本研究结果表明,srt A基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。
张奇文[5]（2018）在《单增李斯特菌表面蛋白基因lmo0159、lmo0160缺失株的构建及部分生物学特性研究》文中研究表明单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）,是一种食源性致病菌,在自然界中广泛存在,常通过污染的食物感染人和动物。该菌为胞内寄生菌,可穿越宿主血脑屏障,肠道屏障及胎盘屏障,临床上引起腹泻、脑膜脑炎、败血症、新生儿溶血、肝炎及流产等症状,发病率及死亡率较高。LM细胞壁表面存在多种毒力蛋白,其中有一类至关重要的表面蛋白,其C-末端区含有LPXTG（Leu-Pro-X-Thr-Gly）保守基序,由分选酶Sort A识别共价结合到细胞壁肽聚糖上,呈现在细胞表面,发挥其毒力作用。根据LM EGD-e参考菌株的全基因组序列预测有41种LPXTG基序蛋白,其中Lmo0159和Lmo0160功能未知,本研究以李斯特菌病绵羊脑分离株LM90SB2为研究对象,对lmo0159、lmo0160基因进行克隆及生物信息学分析;利用同源重组技术分别构建LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160基因缺失株,分析其在环境耐受性、生物被膜形成能力及细胞水平和动物机体毒力的差异,以探讨lmo0159和lmo0160基因的功能,为进一步研究LM的致病机理奠定了基础。主要研究内容和结果如下:1.LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因克隆及序列分析:为了了解LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因编码蛋白的特征,利用PCR方法扩增lmo0159、lmo0160基因,分别连接pMD19-T载体,测序分析其特征。结果显示:lmo0159序列全长2 070bp,编码617个氨基酸;lmo0160序列全长为1 708bp,编码475个氨基酸;lmo0159、lmo0160基因核苷酸序列分别与不同来源4b型LM同源性均高达99%以上。Lmo0159蛋白是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白;Lmo0160蛋白为疏水性蛋白。两种蛋白均含有胶原蛋白结合域和Cna B功能域。本研究成功克隆LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因,并初步预测分析了目的基因部分生物学特征,为进一步研究LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因功能提供了理论依据。2.LM90SB2-（35）lmo0159、LM90SB2-（35）lmo0160缺失株的构建及鉴定:为研究lmo0159、lmo0160基因的功能,本试验利用PCR技术分别扩增lmo0159、lmo0160基因的上下游同源臂,SOE-PCR方法进行同源臂融合,获得（35）lmo0159、（35）lmo0160缺失片段,分别连接到pMD19-T载体,获得pMD19-T-（35）lmo0159、pMD19-T-（35）lmo0160,测序成功后,经双酶切并连接至pKSV7,获得重组穿梭质粒pKSV7-（35）lmo0159和pKSV7-（35）lmo0160,分别电转化到LM90SB2感受态细胞中,获得阳性转化子,置于含10μg/m L氯霉素BHI培养基中,42℃传代培养,获得LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160基因缺失株。再置37℃无抗性BHI培养基传代培养30代,PCR检测遗传稳定性,结果显示LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160基因缺失株构建成功,且遗传稳定。3.LM90SB2-（35）lmo0159、LM90SB2-（35）lmo0160缺失株环境适应性和生物被膜形成能力的研究:为探讨lmo0159和lmo0160基因缺失对LM环境适应性和生物被膜形成能力的影响。本试验测定了不同温度、pH、NaCl、乙醇胁迫环境下细菌生长情况及生物被膜形成能力。结果显示:在37℃和42℃培养条件下,LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160的生长低于LM90SB2;在0.5%和2.5%NaCl BHI中,LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160的生长低于LM90SB2;在3%和3.5%乙醇BHI中,LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160的生长低于LM90SB2;显微镜观察LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160形成生物被膜的交联密集度均低于LM90SB2;生物被膜定量分析发现,随着时间的延长,OD57070 nm差异也增大,尤其在48h,差异均为极极显着（P?0.001）。结果表明,lmo0159和lmo0160基因的缺失降低了LM90SB2对环境的适应性和生物被膜形成能力。4.LM90SB2-（35）lmo0159、LM90SB2-（35）lmo0160缺失株毒力的研究:为探讨lmo0159和lmo0160基因缺失对LM毒力的影响。本试验分别用亲本株和缺失株对MBMEC、RAW264.7、SIEC和HBMEC细胞进行粘附、侵袭及细胞内增殖试验,及对小鼠腹腔感染后测定肝、脾、脑载菌量及小鼠存活时间。结果显示:LM90SB2-（35）lmo0159较LM90SB2,对SIEC及RAW264.7细胞的粘附率、侵袭率均降低,差异极显着（P?0.01）;LM90SB2-（35）lmo0160较LM90SB2,对RAW264.7细胞的粘附率、侵袭率均降低,分别为差异极显着（P?0.01）与差异显着（P?0.05）;缺失株对MBMEC、SIEC及HBMEC的胞内增殖量均降低;缺失株小鼠存活时间较亲本株均显着延长（P<0.05）;LM90SB2-?lmo0159和LM90SB2-?lmo0160对小鼠LD50较LM90SB2分别下降了0.97和0.86个数量级;缺失株较亲本株,在肝和脾中的载菌量均降低。试验结果表明lmo0159和lmo0160基因缺失后均降低了LM90SB2的毒力。
孔静雅[6]（2018）在《FlaA对单核细胞增生李斯特菌LM90SB2毒力及生物被膜形成的影响研究》文中指出单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是一种胞内寄生的革兰氏阳性致病菌,能够引起动物和人类的脑膜炎、流产、败血症等疾病,死亡率能够达到20%-30%,对人类及畜牧业的生产有着重要的危害。研究证实众多的毒力因子与LM的毒力有关,其中鞭毛不仅能介导LM的运动,还在LM对细胞的黏附、侵入和繁殖过程中发挥着重要作用。作者所在实验室从发生“转圈病”的绵羊大脑中分离到1株LM,命名为LM90SB2并进行了大量相关研究,但编码鞭毛亚基的flaA基因对LM90SB2毒力及生物被膜（BF）形成的影响还未见详细报道。本研究通过利用同源重组技术构建LM90SB2的flaA基因缺失株,通过测定缺失株LM90SB2-Δfla A的小鼠LD50测定、细胞的黏附和侵染能力以及BF的形成等的影响,分析FlaA在LM90SB2感染过程中的作用。主要研究内容及结果如下:1.LM90SB2的fla A基因缺失株的构建及其稳定性遗传本实验采用重叠PCR（SOE-PCR）方法得到融合片段ΔflaA,将其与pMD19-T连接后,经过酶切再与酶切后的穿梭质粒pKSV7连接得到p KSV7-ΔflaA,将重组质粒pKSV7-ΔflaA电转化进至LM90SB2感受态细胞中,在氯霉素与温度的压力下进行同源重组。经过30代基因重组获得双交换基因缺失株后,转入无抗性培养基最终获得无抗性的基因缺失株。试验成功构建出具有良好遗传稳定性的LM90SB2的fla A基因缺失株,并命名为LM90SB2-ΔflaA。2.LM90SB2-Δfla A运动能力的测定及对小鼠毒力(LD50)的影响研究采用半固体琼脂法测定细菌的运动性、菌落计数法计算小鼠脏器载菌量、改良寇氏法计算小鼠LD50。与野毒株相比,LM90SB2-ΔflaA的晕圈直径由1.38 cm下降到0.50 cm,运动能力下降了63.77%;与野毒株相比LM90SB2-ΔflaA在感染小鼠肝脏中的载菌量降低,差异显着（p<0.05）,脾脏与肾脏中的载菌量虽有所降低,但差异并不显着（p>0.05）;与野毒株相比,LM90SB2-ΔflaA的LD50值从4.27×106 cfu上升到了1.62×107 cfu,致病能力下降了3.8倍。结果表明FlaA显着影响LM90SB2的运动性和毒力。3.LM90SB2-Δfla A黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7细胞的能力分析将MBMEC细胞和RAW264.7细胞培养成单层,分别按5:1和10:1的比例接种细菌。以LM90SB2为对照,分别于细菌黏附MBMEC细胞、RAW264.7细胞1 h裂解细胞,通过倍比稀释涂板进行菌落计数;细菌分别侵染上述细胞2 h后裂解细胞倍比稀释涂板后进行菌落计数。结果显示LM90SB2-ΔflaA对MBMEC细胞的黏附数（1.6×104 cfu）低于LM90SB2的黏附数（2.8×104 cfu）,差异显着（p<0.05）;侵袭数（5.8×102 cfu）低于LM90SB2（6.5×102 cfu）,但差异并不显着（p>0.05）。LM90SB2-ΔflaA对RAW264.7细胞的黏附数（5.0×105 cfu）和侵袭数（2.3×105 cfu）均低于LM90SB2（8.9×105 cfu和3.3×105 cfu）,差异显着（p<0.05）。试验表明FlaA能影响LM90SB2对细胞黏附和侵袭能力。4.FlaA对LM90SB2生物被膜形成能力的影响将LM90SB2与LM90SB2-ΔflaA培养于96孔细胞培养板,分别于2、6、10、12、24、48 h时用结晶紫染色,荧光倒置显微镜下观察BF形成情况;采用乙醇-丙酮混合液溶解BF,测定OD595定量测定BF的形成量;在含有盖玻片的6孔细胞培养板中培养细菌,用PI或刀豆蛋白A染色后,置于激光共聚焦显微镜下观察BF的形成情况。结果显示,光学显微镜下观察LM90SB2-ΔflaA和LM90SB2形成BF规律相似,即均在10 h左右形成较为完整的网状结构,但LM90SB2-ΔflaA整体结构松散、致密性差。在37℃时,LM90SB2-ΔflaA和LM90SB2的BF形成的OD值规律大致相同,均在10 h左右进入稳定期,但整个过程LM90SB2-Δfla A形成BF量均偏少,差异显着（p<0.05）。25℃时,LM90SB2-ΔflaA的BF形成规律与LM90SB2大致相同,但形成过程中每个时间点LM90SB2-ΔflaA BF量下降明显,且差异极显着（p<0.01）。激光共聚焦显微镜观察结果显示LM90SB2-ΔflaA的BF结构中核酸与多糖的分布松散、稀疏、散点状分布。表明FlaA在LM90SB2的BF形成过程中起到重要的促进作用,且温度对缺失株BF的形成有明显影响。本研究通过同源重组方法构建了flaA基因缺失株LM90SB2-ΔflaA,并研究了flaA基因缺失对LM90SB2毒力、及BF形成能力等的影响。发现与LM90SB2相比LM90SB2-ΔflaA的运动能力显着降低,对小鼠的毒力、细胞的黏附和侵袭能力、BF形成能力降低,证实fla A基因对LM90SB2的毒力及BF形成能力等起着一定的作用。
魏丽,邓兴梅,蒋建军,剡根强,马勋,王鹏雁[7]（2014）在《单增李斯特菌inlB基因缺失株的构建及其生物学特性》文中研究表明为探究单增李斯特菌inlB基因缺失株的生物学特性,利用同源重组技术成功构建了inlB基因突变株（LM90-△inlB）。对突变株进行了溶血试验、细菌计数小鼠肝、脾和脑载菌试验测定、体外耐酸碱生长培养试验及鼠脑微血管内皮细胞侵袭、黏附、增殖试验。结果显示,突变株溶血活性无变化;小鼠肝脏载菌量突变株低于亲本株,但差异不显着,脾脏载菌量无差异;突变株的毒力显着降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株有明显升高（P<0.05）;在体外耐酸碱生长能力培养中,inlB突变株耐酸性没有改变,而耐碱能力强于亲本株;细胞黏附侵袭及增殖试验表明突变株明显低于亲本株（P<0.05）。说明inlB基因对LM90的毒力具有一定的调控作用,结果对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了科学依据。
袁兆尤[8]（2014）在《单核细胞增生李斯特菌InlC基因缺失株的构建及其毒力和环境耐受性的研究》文中指出单核细胞增生李斯特菌（listeria monocytogenes,LM）是一种常见的食源性致病菌,可以引起人类的李斯特菌病。此菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性菌,可以引起孕畜（妇）流产和脑膜炎等疾病,是对人畜具有较大危害的人兽共患病病原。LM是短小的无芽胞杆菌,常呈V字形或成对排列,属微需氧菌,对营养要求不高,在普通培养基上能生长,耐碱、耐盐、耐热。该菌生长温度一般为30-38℃,但在4℃条件下仍能生长繁殖,其最低生长温度为0.1-0.4℃。根据菌体和鞭毛抗原成分,其中致病血清型有1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b,而以4b型引起发病较多。LM是典型的胞内寄生菌,不仅可以在吞噬细胞内生长,也能在上皮细胞和肝细胞内生长,可以通过损伤的黏膜经神经末梢的鞘膜侵犯中枢神经系统。该菌编码与胞内寄生生活循环有关的毒力基因有2簇,分别为李斯特菌毒力岛1（LIPI-1）和李斯特菌毒力岛2（LIPI-2）。LIPI—1有6个基因,两侧分别为prs和ldh位点,从prs下游开始,依次为转录活化因子编码基因prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB。LIPI-2又称为内化素小岛,内化素是指一个富含亮氨酸重复序列的蛋白质家族,分为2个亚族,亚族1的代表是由InlAB基因编码的InlA和InlB多肽,亚族2是由相对分子质量较小（2500030000）的蛋白质组成,原形来自LM的InlC。鉴于此,本研究构建了LM90SB2-△InlC基因缺失株,并开展了缺失株毒力和环境耐受性研究,探讨了LM的Inl C因子在其毒力和环境耐受性方面的调控作用,为LM弱毒疫苗的研发提供了科学依据。主要研究内容和结果如下:1、LM90SB2-△InlC基因缺失株的构建与分子鉴定:首先,在NCBI网站上查找出InlC基因序列,设计出用于基因缺失的上、下游同源臂引物;然后,以LM90SB2DNA为模板,利用PCR技术扩增出InlC基因两侧的上游同源臂和下游同源臂;接着运用基因重叠PCR（SOE-PCR）技术分两步将扩增出的上、下游同源臂融合,获得InlC基因缺失片段;然后将InlC基因缺失片段插入到穿梭载体PKSV7中,构建重组穿梭质粒pKSV7-△Inl C。将pKSV7-△InlC电转化到LM90SB2中,用检测引物（L1、L4）对电转后的菌株和传代培养的菌株进行PCR鉴定及测序分析。结果筛选得到可以扩增出1910bp和1026bp两条目的片段的阳性转化子;对阳性转化子在氯霉素压力41℃条件下传代培养30代,获得具有氯霉素抗性的单交换重组株;然后再在氯霉素压力41℃条件下继续传代培养至108代,得到只能扩增出1026bp一条目的片段无氯霉素抗性的双交换基因重组缺失株LM90SB2-△InlC;用新设计的旁侧引物检测只能检测到一条长度为1480bp的条带;继续在无氯霉素压力37℃条件下传代培养30代,LM90SB2-△InlC无返祖现象,说明该缺失株具有遗传稳定性。2、LM90SB2-△InlC基因缺失株对毒力的影响:通过小鼠半数致死量（LD50）、肝、脾、脑载菌量、溶血试验、鼠脑微血管内皮细胞粘附、侵袭和胞内增殖试验分析缺失株LM90SB2-△InlC和野毒株LM90SB2在毒力上的差异。结果显示:LM90SB2-△InlC的LD50为107CFU,LM90SB2的LD50为104.5CFU,LM90SB2-△InlC的LD50是野毒株的102.5倍（P<0.01）;在不同时间点,LM90SB2-△InlC缺失株在小鼠肝和脾内的载菌量均少于LM90SB2（P<0.05）;溶血实验结果显示,LM90SB2-△InlC以及LM90SB2均呈现出β溶血;鼠脑微血管内皮细胞粘附、侵袭和胞内增殖实验结果显示:LM90SB2-△InlC的粘附率为2.63%,而野生株LM90SB2的黏附率为3.72%,两者相差1.09%（P<0.01）;LM90SB2-△InlC的侵袭率为0.033%,LM90SB2的侵袭率为1.40%,野生株对MBMEC的侵袭率明显高于缺失株对MBMEC的侵袭率（P<0.01）;在2-12h之间LM90SB2-△InlC在鼠脑微血管内皮细胞内的存活数量明显是低于LM90SB2（P<0.05）的。结果提示InlC与LM的毒力相关。3、LM90SB2-△InlC基因缺失株对环境耐受性的影响:为了检测缺失株在环境耐受性方面的变化,通过人工模拟不同温度,不同pH的应激环境,分析了LM90SB2-△InlC缺失株和野毒株LM90SB2在环境耐受性的差异。试验结果表明:与野毒株LM90SB2相比,LM90SB2-△Inl C对温度和pH的环境应激耐受力几乎没有变化,提示在温度、pH的应激过程中可能不需要InlC的参与。
皮志媛,王一明,张海兰,雷程红[9]（2014）在《伊犁地区绵羊李氏杆菌药敏特性及平板凝集快速诊断方法的建立》文中研究说明[目的]建立一种快速检测李氏杆菌病的方法。[方法]通过对实验室保存的5株李氏杆菌分离株进行药敏试验,用甲醛灭活苗免疫试验动物,制备特异性抗体,将特异性抗体与抗原进行平板凝集试验。[结果]分离菌株对氨苄西林、庆大霉素、链霉素高度敏感,对头孢唑啉、左氧氟沙星和多粘菌素中度敏感,对头孢他啶、头孢呋辛钠耐药性较强。通过用甲醛灭活苗免疫试验动物来制备特异性抗体,将特异性抗体与抗原做平板凝集试验,建立一种快速准确检测李氏杆菌病的方法。[结论]成功建立了一种快速检测李氏杆菌病的方法。
郑德良,马勋[10]（2013）在《单核细胞增多性李斯特菌人工感染小鼠致其脑炎模型的建立及优化》文中研究说明采用不同剂量单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）LM90SB2腹腔注射感染小鼠219只,观察小鼠临床症状,纪录死亡情况,在感染后不同时间采集小鼠脑组织,进行脑组织中细菌回收、鉴定及病理组织学观察。结果显示,不同感染剂量感染小鼠,其临床症状和脑组织病理变化基本一致。但是随着感染剂量的增加,其临床症状出现时间逐渐缩短,死亡率和脑组织中细菌分离的时间明显不同。1/2LD50剂量组小鼠未出现死亡,2/3LD50组和LD50组死亡率分别为12.5%和63.3%;另外1/2LD50组感染后24h开始从脑组织中离到LM,96h所有感染小鼠脑组织均能分离到LM,2/3LD50组感染后12h开始能分离到LM,72h所有脑组织均能分离到LM。从小鼠临床症状及死亡率、脑组织细菌的回收情况和脑组织病理组织学变化综合考虑,以2/3LD50LM LM90SB2腹腔感染小鼠为动物感染模型。
二、致绵羊脑炎单核细胞增多症李氏杆菌的分离与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、致绵羊脑炎单核细胞增多症李氏杆菌的分离与鉴定（论文提纲范文）
（1）单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成过程的转录组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 外文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 单增李斯特菌的研究进展 |
| 1.1 单增李斯特菌生物学性状 |
| 1.2 单增李斯特菌病的流行病学特征 |
| 1.3 单增李斯特菌的感染机理 |
| 1.4 单增李斯特菌病的临床症状 |
| 2 生物被膜的研究进展 |
| 2.1 生物被膜的形成 |
| 2.2 生物被膜的危害 |
| 2.3 影响生物被膜形成的因素 |
| 2.4 生物被膜的制备和检测方法 |
| 2.4.1 常用的制备方法 |
| 2.4.2 常用的检测方法 |
| 3 RNA-Seq技术的研究进展 |
| 3.1 RNA-Seq的原理 |
| 3.2 RNA-Seq的应用 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 5 下一步研究的建议与展望 |
| 第二章 单增李斯特菌生物被膜形成条件的优化 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 试剂的配制方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 菌株的复苏与活化 |
| 2.2 试管、载玻片培养法观察生物被膜的形成 |
| 2.3 微孔板定量法测定生物被膜的形成 |
| 2.3.1 培养时间对生物被膜形成的影响 |
| 2.3.2 培养基浓度对生物被膜形成的影响 |
| 2.3.3 温度对生物被膜形成的影响 |
| 2.3.4 pH值对生物被膜形成的影响 |
| 2.3.5 NaCl浓度对生物被膜形成的影响 |
| 2.3.6 葡萄糖浓度对生物被膜形成的影响 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 培养时间对生物被膜形成的影响 |
| 3.1.1 试管培养法观察生物被膜的形成能力 |
| 3.1.2 载玻片培养法观察生物被膜的形成能力 |
| 3.1.3 微孔板法测定生物被膜的形成能力 |
| 3.2 培养基浓度对生物被膜形成的影响 |
| 3.3 温度对生物被膜形成的影响 |
| 3.4 pH值对生物被膜形成的影响 |
| 3.5 NaCl浓度对生物被膜形成的影响 |
| 3.6 葡萄糖浓度对生物被膜形成的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 单增李斯特菌的转录组测序及数据分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 试剂的配制方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 菌株的复苏与活化 |
| 2.2 测序样品的制备 |
| 2.2.1 浮游菌 |
| 2.2.2 生物被膜菌 |
| 2.3 总RNA提取 |
| 2.4 文库构建 |
| 2.5 RNA-Seq |
| 2.6 数据分析 |
| 2.6.1 质量控制 |
| 2.6.2 样品与参考基因组比对 |
| 2.6.3 基因表达定量分析 |
| 2.6.4 基因表达差异分析 |
| 2.6.5 富集分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RNA质量检测 |
| 3.2 RNA完整性检测 |
| 3.3 质量控制 |
| 3.4 样品与参考基因组比对 |
| 3.5 基因表达定量分析 |
| 3.5.1 基因表达分布 |
| 3.5.2 样品间相关性 |
| 3.5.3 主成分分析 |
| 3.6 基因表达差异分析 |
| 3.7 富集分析 |
| 3.7.1 GO功能富集 |
| 3.7.2 KEGG通路富集 |
| 4 讨论 |
| 第四章 转录组测序中差异表达基因的验证 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 试剂的配制方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 总RNA提取 |
| 2.3 cDNA合成 |
| 2.4 普通PCR验证 |
| 2.4.1 模板质量 |
| 2.4.2 引物特异性 |
| 2.5 实时荧光定量PCR验证 |
| 2.6 Northern blot验证 |
| 2.6.1 探针标记效率检测 |
| 2.6.2 8%聚丙烯酰胺变性胶电泳 |
| 2.6.3 转膜 |
| 2.6.4 交联 |
| 2.6.5 预杂交 |
| 2.6.6 杂交 |
| 2.6.7 洗膜 |
| 2.6.8 封闭、孵育与曝光 |
| 3 结果 |
| 3.1 普通PCR验证 |
| 3.2 实时荧光定量PCR验证 |
| 3.3 Northern blot验证 |
| 3.3.1 探针标记效率检测 |
| 3.3.2 Northern blot杂交 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
| 导师简介 |
（2）单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株构建及炎性因子对小鼠血脑屏障损伤作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究目的及意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 单增李斯特菌概述 |
| 2.2 单增李斯特菌的生物学特性 |
| 2.3 单增李斯特菌的致病力 |
| 2.4 单增李斯特菌感染的致病机理 |
| 2.5 单增李斯特菌的毒力因子及调控因子 |
| 2.6 单增李斯特菌侵染中枢神经系统研究进展 |
| 3 研究内容与技术路线 |
| 3.1 主要研究内容 |
| 3.2 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株的构建 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 引物设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 inlJ上、下游同源臂的扩增及融合 |
| 2.2 inlJ缺失片段的克隆与测序 |
| 2.3 重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ的构建 |
| 2.4 Lm90-ΔinlAB感受态细胞的制备 |
| 2.5 电转化及Lm90-ΔinlABJ缺失株的筛选与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 inlJ基因上下游臂的扩增及SOE-PCR结果 |
| 3.2 重组质粒pKSV7-ΔinlJ的双酶切鉴定 |
| 3.3 电转后阳性转化子筛选与鉴定 |
| 3.4 同源重组子的筛选与鉴定 |
| 3.5 缺失株的遗传稳定性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验二 单增李斯特菌Δinl ABJ缺失株部分生物学特性研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 缺失株培养特性及生长曲线测定 |
| 2.2 缺失株溶血特性测定 |
| 2.3 细胞黏附、侵袭及胞内增殖能力测定 |
| 2.4 小鼠存活试验 |
| 2.5 半数致死量(LD50)测定 |
| 2.6 小鼠组织载菌量测定 |
| 2.7 绵羊感染试验 |
| 2.8 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 培养特性 |
| 3.2 生长曲线测定 |
| 3.3 溶血测定 |
| 3.4 细胞侵袭及胞内增殖 |
| 3.5 缺失株对小鼠的毒力试验 |
| 3.6 小鼠LD50测定 |
| 3.7 小鼠组织载菌量测定 |
| 3.8 绵羊感染试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验三 单增李斯特菌对小鼠血脑屏障损伤及其可能机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及实验动物 |
| 1.2 主要实验器材 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠感染试验 |
| 2.2 感染小鼠BBB通透性测定 |
| 2.3 脑组织取材、固定及切片制作 |
| 2.4 HE染色及免疫组化 |
| 2.5 组织样品RNA、蛋白提取 |
| 2.6 cDNA模板制备 |
| 2.7 SYBR Green法荧光定量PCR |
| 2.8 蛋白质免疫印迹 |
| 2.9 细胞因子测定 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同感染剂量小鼠存活率 |
| 3.2 感染小鼠眼观症状 |
| 3.3 小鼠脑组织细菌回收及鉴定 |
| 3.4 小鼠脑病理组织学观察 |
| 3.5 小鼠脑组织载菌量测定 |
| 3.6 感染小鼠BBB通透性变化 |
| 3.7 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达变化 |
| 3.8 ZO-1、Occludin、Claudin-5 免疫组化测定 |
| 3.9 单增李斯特菌感染促进TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平表达 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验四 炎性因子对体外血脑屏障模型损伤的影响作用研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及细胞 |
| 1.2 主要试验器材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞的分离培养 |
| 2.2 脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞的免疫荧光鉴定 |
| 2.3 体外血脑屏障模型的构建 |
| 2.4 体外血脑屏障模型的评估 |
| 2.5 WB检测体外血脑屏障模型紧密连接蛋白表达 |
| 2.6 小鼠巨噬细胞复苏及培养 |
| 2.7 单增李斯特菌感染RAW264.7 细胞 |
| 2.8 qRT-PCR检测细胞因子的表达 |
| 2.9 ELISA检测细胞因子的表达 |
| 2.10 单增李斯特菌感染RAW264.7 细胞后上清制备 |
| 2.11 感染单增李斯特菌的RAW264.7 细胞产物对BBB通透性的影响 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鼠脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞形态学观察 |
| 3.2 鼠脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞免疫荧光鉴定 |
| 3.3 跨内皮细胞间电阻(TEER)测定 |
| 3.4 液面试漏试验 |
| 3.5 辣根过氧化物酶(HRP)通透性测定 |
| 3.6 紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表达 |
| 3.7 单增李斯特菌感染可诱导RAW264.7 细胞炎性因子的表达 |
| 3.8 感染单增李斯特菌的RAW264.7 细胞产物可影响BBB的通透性 |
| 3.9 感染单增李斯特菌的RAW264.7 细胞产物可调节BMECs紧密连接蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 结论 |
| 第四章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（3）产单核细胞李氏杆菌的临床分离与FlaA单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 第一章 产单核细胞李氏杆菌的临床检测及其耐药性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 参考菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 样品的采集与处理 |
| 2.3 细菌DNA模板的制备 |
| 2.4 快速PCR检测方法的确立 |
| 2.5 样品快速检测 |
| 2.6 阳性株的纯培养 |
| 2.7 细菌的质谱鉴定 |
| 2.8 生化鉴定 |
| 2.9 细菌的血清型多重PCR鉴定 |
| 2.10 生物被膜形成能力分析 |
| 2.11 细菌的药物敏感性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR检测方法的确立 |
| 3.2 样品的快速检测结果 |
| 3.3 细菌的纯培养与分离 |
| 3.4 细菌的质谱鉴定结果 |
| 3.5 生化鉴定 |
| 3.6 细菌血清型多重PCR结果 |
| 3.7 细菌的生物被膜形成能力分析 |
| 3.8 细菌的药物敏感性结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 产单核细胞李氏杆菌FlaA的原核表达及抗原性鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 工具酶及试剂 |
| 1.3 设备与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 PCR模板的制备 |
| 2.3 产单核细胞李氏杆菌flaA的PCR扩增 |
| 2.4 flaA的克隆与筛选 |
| 2.5 flaA原核表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.7 重组蛋白的纯化及其抗原性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 产单核细胞李氏杆菌flaA的PCR扩增 |
| 3.2 原核表达载体鉴定 |
| 3.3 重组菌pGEX-flaA诱导表达的SDS-PAGE分析 |
| 3.4 重组蛋白的纯化及抗原性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 产单核细胞李氏杆菌FlaA单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和蛋白 |
| 1.2 细胞和实验动物 |
| 1.3 细胞培养基及基本试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 饲养细胞的制备 |
| 2.3 骨髓瘤细胞SP2/0的制备 |
| 2.4 脾淋巴细胞的制备 |
| 2.5 细胞融合 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.7 腹水的制备及其效价的测定 |
| 2.8 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 2.9 单克隆抗体的纯化 |
| 2.10 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体稳定性检测 |
| 2.12 单克隆抗体的初步应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数的确定 |
| 3.2 间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞 |
| 3.3 腹水效价的测定 |
| 3.4 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.5 单克隆抗体的纯化 |
| 3.6 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.7 单克隆抗体稳定性鉴定 |
| 3.8 单克隆抗体的初步应用 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株、质粒、细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 实验小鼠 |
| 1.1.4 相关引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 srtA基因的克隆与分析 |
| 1.2.2 LM90SB2-?srtA缺失株的构建 |
| 1.2.3 细胞侵染实验 |
| 1.2.3. 1 细胞和细菌的培养 |
| 1.2.3. 2 细菌对细胞的粘附与侵袭 |
| 1.2.3. 3 细菌在细胞内的增殖 |
| 1.2.4 小鼠毒力实验 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LM分离株LM90SB2 srtA基因的扩增与分析 |
| 2.2 LM90SB2 srtA基因缺失株的构建 |
| 2.3 LM分离株LM90SB2和缺失株LM90SB2-?srtA对不同种类细胞的感染能力分析 |
| 2.4 srtA基因的缺失对小鼠致病能力的影响 |
| 3 讨论 |
（5）单增李斯特菌表面蛋白基因lmo0159、lmo0160缺失株的构建及部分生物学特性研究（论文提纲范文）
| 全文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 绪论 |
| 单增李斯特菌LPXTG基序蛋白研究进展 |
| 1 单增李斯特菌一般特性 |
| 1.1 病原学特性 |
| 1.2 流行病学特性 |
| 1.3 发病机制 |
| 2 单增李斯特菌LPXTG基序蛋白 |
| 2.1 InlA |
| 2.2 InlF |
| 2.3 InlJ |
| 2.4 InlH |
| 2.5 InlI |
| 2.6 肌动蛋白聚集因子ActA(Lmo2085) |
| 2.7 Vip(Lmo0320) |
| 2.8 LapB(Lmo1666) |
| 2.9 其他LPXTG表面蛋白功能 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 单增李斯特菌lmo0159、lmo0160基因克隆及序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 实验试剂配制方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 LM90SB2菌株基因组的提取 |
| 2.2 PCR反应体系 |
| 2.3 目的基因片段胶回收 |
| 2.4 pMD19-T载体连接及转化 |
| 2.5 质粒的制备及测序 |
| 2.6 序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增与克隆 |
| 3.2 lmo0159基因序列同源性比对及遗传进化树 |
| 3.3 lmo0160基因序列同源性比对及遗传进化树 |
| 3.4 Lmo0159蛋白的结构和功能预测 |
| 3.5 Lmo0160蛋白的结构和功能预测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验二 单增李斯特菌lmo0159、lmo0160基因缺失株的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 实验试剂配制方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 LM90SB2基因组的提取 |
| 2.2 上下游同源臂扩增及基因重叠PCR(SOE-PCR) |
| 2.3 基因缺失盒与pMD19-T连接 |
| 2.4 重组穿梭质粒pKSV7-(35)X的构建 |
| 2.5 LM90SB2感受态细胞的制备(青霉素G法) |
| 2.6 电转化 |
| 2.7 同源重组 |
| 2.8 基因缺失株遗传稳定性及生长曲线的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 lmo0159和lmo0160基因上下游同源臂扩增结果 |
| 3.2 基因重叠PCR扩增结果和测序鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒pMD19-T-(35)X和pKSV7-(35)X酶切鉴定结果 |
| 3.4 电转后阳性转化子筛选与鉴定 |
| 3.5 同源重组的筛选与鉴定 |
| 3.6 基因缺失株遗传稳定行鉴定及生长曲线 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验三 lmo0159、lmo0160基因缺失对单增李斯特菌环境适应性和生物被膜形成的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 生化特性鉴定 |
| 2.2 不同温度的生长曲线测定 |
| 2.3 不同pH的生长曲线测定 |
| 2.4 不同NaCl浓度条件下的生长曲线测定 |
| 2.5 不同EtOH浓度条件下的生长曲线测定 |
| 2.6 结晶紫染色法观察生物被膜形态 |
| 2.7 结晶紫染色法测定生物被膜形成能力 |
| 2.8 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生化鉴定 |
| 3.2 不同温度的生长曲线测定 |
| 3.3 不同pH的生长曲线测定 |
| 3.4 不同NaCl浓度条件下的生长曲线测定 |
| 3.5 不同EtOH浓度条件下的生长曲线测定 |
| 3.6 生物被膜形态学观察 |
| 3.7 生物被膜形成能力测定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验四 lmo0159、lmo0160基因缺失对单增李斯特菌致病力的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞株及试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌悬液的制备 |
| 2.2 细胞的培养 |
| 2.3 粘附试验 |
| 2.4 侵袭试验 |
| 2.5 细胞内增殖试验 |
| 2.6 小鼠存活率 |
| 2.7 LD50的测定 |
| 2.8 小鼠肝、脾、脑载菌量的测定 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞粘附试验结果 |
| 3.2 细胞侵袭试验结果 |
| 3.3 细胞内增殖试验结果 |
| 3.4 小鼠存活率 |
| 3.5 LD50测定结果 |
| 3.6 小鼠肝、脾、脑载菌量的测定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 结论 |
| 第四章 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（6）FlaA对单核细胞增生李斯特菌LM90SB2毒力及生物被膜形成的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.引言 |
| 2.单核细胞增生李斯特菌的致病性与生物被膜的研究进展 |
| 2.1 单核细胞增生李斯特菌的致病机理 |
| 2.1.1 LM的毒力因子 |
| 2.1.2 LM毒力基因调控因子 |
| 2.2 生物被膜对细菌致病性的影响 |
| 2.2.1 影响BF形成的因素 |
| 2.2.2 检测BF的常用方法 |
| 3.研究内容和研究方法 |
| 第二章 试验内容 |
| 试验一：LM90SB_2的flaA基因缺失株的构建 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 引物 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 LM90SB_2基因组的提取 |
| 1.2.2 LM90SB_2中flaA基因的PCR扩增检测 |
| 1.2.3 LM90SB_2的flaA基因的克隆鉴定 |
| 1.2.4 flaA基因上下游同源臂片段的扩增和融合 |
| 1.2.5 融合重组片段与pMD19-T的连接 |
| 1.2.6 融合重组片段与pKSV7质粒的连接 |
| 1.2.7 电转化 |
| 1.2.8 同源重组、阳性转化子的筛选鉴定 |
| 1.2.9 菌落形态及及遗传稳定性检测 |
| 2.结果 |
| 2.1 flaA基因的扩增结果 |
| 2.2 flaA基因的上下游片段的扩增 |
| 2.3 融合PCR扩增结果 |
| 2.4 T载体连接后酶切及测序结果的分析 |
| 2.5 pKSV7-ΔflaA载体连接后酶切及测序结果的分析 |
| 2.6 阳性转化菌的筛选和稳定性检测 |
| 2.7 菌落形态及生长曲线的测定 |
| 2.7.1 菌落的形态观察 |
| 2.7.2 细菌的生长曲线的测定 |
| 3.讨论 |
| 3.1 关于基因功能研究方法 |
| 3.2 生长曲线测定 |
| 4.小结 |
| 试验二：flaA基因对LM90SB_2的运动能力、小鼠脏器载菌量及毒力的影响研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 LM90SB_2-ΔflaA的运动性试验 |
| 1.2.2 肝、脾、肾载菌量的测定 |
| 1.2.3 小鼠半数致死量的测定 |
| 2.结果 |
| 2.1 运动性试验结果 |
| 2.2 肝、脾、肾脏载菌量的测定结果 |
| 2.3 小鼠半数致死量的测定结果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 鞭毛的运动与毒力 |
| 3.2 LM与载菌量的关系 |
| 4.小结 |
| 试验三：FlaA对LM90SB_2细胞黏附、侵袭能力影响的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 对MBMEC细胞的黏附、侵袭 |
| 1.2.2 对RAW264.7细胞的黏附、侵袭 |
| 2.结果 |
| 2.1 LM90SB_2与LM90SB_2-ΔflaA对MBMEC细胞黏附和侵袭结果 |
| 2.2 LM90SB_2与LM90SB_2-ΔflaA对RAW264.7细胞的黏附和侵袭结果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 MBMEC细胞与RAW264.7细胞的选择 |
| 3.2 鞭毛对细胞的黏附和侵袭作用 |
| 4.小结 |
| 试验四：flaA基因对LM90SB_2的BF形成能力影响的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 定性观察BF的形成差异—结晶紫染色观察BF的形成 |
| 1.2.2 定量检测BF的形成量—96孔板检测法(polystyrenemicrotiterplateassay) |
| 1.2.3 定性观察BF的形成差异—激光共聚焦显微镜观察BF的形成 |
| 2.结果 |
| 2.1 BF的形态结构的观察—结晶紫染色法 |
| 2.2 BF形成量的测定结果 |
| 2.3 BF的形态结构的观察—激光共聚焦显微镜(CLSM)观察法 |
| 3.讨论 |
| 3.1 鞭毛对BF的影响作用 |
| 3.2 温度对BF形成影响 |
| 4.小结 |
| 第三章 全文结论 |
| 第四章 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（8）单核细胞增生李斯特菌InlC基因缺失株的构建及其毒力和环境耐受性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章：文献综述 单核细胞增生李斯特菌研究进展 |
| 1 单核细胞增多症李斯特菌概况 |
| 2 李斯特菌病 |
| 2.1 脑炎 |
| 2.2 流产 |
| 2.3 败血症 |
| 3 单核细胞增多症李斯特菌毒力岛和毒力因子 |
| 3.1 毒力岛 1（ LIPI-1） |
| 3.2 毒力岛 2（LIPI-2） |
| 3.3 李斯特菌溶血素O |
| 3.4 肌动蛋白聚集因子（Act A） |
| 3.5 转录活化因子（PrfA） |
| 3.6 磷脂酶C（PLC） |
| 4 内化素 |
| 4.1 内化素A（InlA） |
| 4.2 内化素B（InlB） |
| 4.3 内化素C（InlC） |
| 4.4 其他内化素 |
| 5 单核细胞增多症李斯特菌致病机理 |
| 5.1 细胞感染过程 |
| 5.2 体内感染过程 |
| 第二章：实验内容 |
| 试验一LM InlC基因缺失株的构建及分子鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 LM90SB2基因组的提取 |
| 2.2 基因重叠PCR(SOE-PCR) |
| 2.3 Inl C基因缺失片段的克隆和测序 |
| 2.4 重组穿梭质粒pKSV7-△InlC的构建 |
| 2.5 电转用感受态细胞的制备（青霉素G法） |
| 2.6 电转化和同源重组 |
| 2.7 同源重组株遗传稳定性检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 上游同源臂和下游同源臂的扩增结果 |
| 3.2 基因重叠PCR扩增结果和测序鉴定结果 |
| 3.3 重组穿梭质粒p KSV7-△RsbV鉴定结果 |
| 3.4 不同时期菌的PCR鉴定 |
| 3.5 重组InlC基因缺失株稳定遗传性的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 试验二LM90SB2-△InlC对单核细胞增多症李斯特菌毒力的影响 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株以及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂的配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 LD50的测定 |
| 2.2 小鼠肝、脾、脑载菌量的测定 |
| 2.3 溶血实验 |
| 2.4 鼠脑微血管内皮细胞（MBMEC）侵染实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠LD50的测定结果 |
| 3.2 肝、脾、脑载菌量试验结果 |
| 3.3 溶血试验 |
| 3.4 MBMEC的侵染试验 |
| 4 讨论 |
| 试验三LM90SB2-△InlC对单核细胞增多症李斯特菌环境耐受性的影响 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株以及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 不同酸碱环境条件下的生长试验 |
| 2.2 不同温度条件下生长实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同酸碱环境条件下的生长实验 |
| 3.2 不同温度条件下生长试验 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 1.测序结果 |
| 2.作者简介 |
| 3.发表论文 |
| 导师评阅表 |
（9）伊犁地区绵羊李氏杆菌药敏特性及平板凝集快速诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
（10）单核细胞增多性李斯特菌人工感染小鼠致其脑炎模型的建立及优化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 半数致死量的测定 |
| 1.4 感染模型的建立及优化 |
| 1.4.1 LM90SB2感染小鼠的临床观察及死亡率 |
| 1.4.2 脑组织细菌的分离 |
| 1.4.3 分离细菌的PCR鉴定 |
| 1.4.4 脑组织病理组织学观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 LD50的测定 |
| 2.2 动物模型临床观察及死亡率 |
| 2.2.1 1/2 LD50组 |
| 2.2.2 2/3 LD50组 |
| 2.2.3 LD50组 |
| 2.3 脑组织细菌的回收及鉴定 |
| 2.4 脑组织病理组织学观察 |
| 2.4.1 大脑病变化 |
| 2.4.2 2/3LD50组小鼠小脑和脑桥病理变化 |
| 3 讨论 |
四、致绵羊脑炎单核细胞增多症李氏杆菌的分离与鉴定（论文参考文献）
- [1]单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成过程的转录组学分析[D]. 曹启航. 甘肃农业大学, 2021
- [2]单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株构建及炎性因子对小鼠血脑屏障损伤作用研究[D]. 任静静. 石河子大学, 2020(08)
- [3]产单核细胞李氏杆菌的临床分离与FlaA单克隆抗体的制备[D]. 熊静禹. 扬州大学, 2020(04)
- [4]单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究[J]. 张奇文,凌晨,吴学林,马勋,薄新文. 中国动物传染病学报, 2019(04)
- [5]单增李斯特菌表面蛋白基因lmo0159、lmo0160缺失株的构建及部分生物学特性研究[D]. 张奇文. 石河子大学, 2018(12)
- [6]FlaA对单核细胞增生李斯特菌LM90SB2毒力及生物被膜形成的影响研究[D]. 孔静雅. 石河子大学, 2018(12)
- [7]单增李斯特菌inlB基因缺失株的构建及其生物学特性[J]. 魏丽,邓兴梅,蒋建军,剡根强,马勋,王鹏雁. 动物医学进展, 2014(10)
- [8]单核细胞增生李斯特菌InlC基因缺失株的构建及其毒力和环境耐受性的研究[D]. 袁兆尤. 石河子大学, 2014(03)
- [9]伊犁地区绵羊李氏杆菌药敏特性及平板凝集快速诊断方法的建立[J]. 皮志媛,王一明,张海兰,雷程红. 安徽农业科学, 2014(02)
- [10]单核细胞增多性李斯特菌人工感染小鼠致其脑炎模型的建立及优化[J]. 郑德良,马勋. 中国兽医学报, 2013(07)