牦牛源A群轮状病毒的分子检测和基因组研究

论文摘要

牛A群轮状病毒（Bovine rotavirus A,BRVA）是导致犊牛腹泻的重要病原,给全世界养牛业带来巨大的经济损失;并且BRVA跨种间传播的公共卫生意义越来越受到关注。本实验室前期研究结果显示,青藏高原牦牛BRVA的感染普遍,是导致犊牦牛腹泻的重要原因。但目前牦牛源BRVA的分子特征和基因组研究资料严重匮乏,制约了该病的防控。本研究的目的是调查当前青藏高原牦牛源BRVA的流行基因型和基因组特征,取得如下成果:1.2017-2018年青藏高原部分地区牦牛源A群轮状病毒的检测为了解当前BRVA在青藏高原部分地区牦牛中的流行情况,于2017年6月-2018年7月采集了川西北草原和西藏阿里地区的29个牧场共219份犊牦牛（≦3月龄）腹泻粪便样本,采用特异性RT-PCR方法对BRVA进行检测,并进一步对BRVA与BCoV和BVDV的混合感染情况进行调查。结果显示,川西北地区牦牛源BRVA的检出率为61.62%（114/185）,西藏阿里地区牦牛源BRVA的检出率为52.94%（18/34）,证实BRVA感染仍然是当前川西北和西藏阿里地区引起犊牦牛腹泻的主要原因。其中,BRVA与BCoV的混合感染率为70.45%（93/132）,与BVDV混合感染率为18.94%（25/132）,并且与BCoV和BVDV混合感染情况严重,为犊牦牛腹泻的诊断和防控提供了参考。2.牦牛源A群轮状病毒VP4和VP7基因的分子特征研究VP4和VP7蛋白是轮状病毒的外衣壳蛋白,可诱导机体产生中和抗体,VP4决定P型,VP7决定G型。为了解牦牛源BRVA的VP4和VP7分子特征,本研究随机选取四川、西藏、青海、云南地区的86份牦牛源BRVA阳性样本,接种MA-104细胞进行盲传3代后,经RT-PCR检测为BRVA阳性的样本用于扩增VP4和VP7部分基因序列,利用RotaC软件进行分型,并分析其分子特征。结果表明,86份样本中,65份样本检测为BRVA阳性。其中34个样本扩增出长度为667bp的VP4基因片段,分型结果表明,P[1]型为94.12%（32/34）,P[11]型为5.88%（2/34）。26个样本扩增出长度为885bp的VP7基因片段,分型结果表明,G6型为88.46%（23/26）,G10型为11.54%（3/26）。同时扩增出VP4和VP7基因的17个样本中,G6P[1]型为94.12%（16/17）,G6P[11]型为5.88%（1/17）,G6P[1]型是青藏高原地区牦牛中的主要基因型。系统发育树表明,来自4个不同省份的G6型毒株VP7基因和P[1]型毒株VP4基因分别独立的聚为一大支,未显示出地域的区别,并且与国内牛源G6型和P[1]型毒株有显著的遗传距离,表明G6P[1]型牦牛源BRVA有着独特的进化特征,丰富了牦牛源BRVA的分子特征资料,为犊牦牛腹泻的防控提供了重要参考。3.牦牛源A群轮状病毒的分离鉴定和基因组研究轮状病毒基因组分为11个节段,基因重配是轮状病毒遗传进化过程中的常见现象。为了更好的了解RV的遗传多样性,已经建立了基于基因组的分型系统。目前GenBank中只有1个国内的BRVA基因组,且无牦牛源BRVA基因组。为更好的了解牦牛源BRVA的分子特征和遗传进化,本实验分离得到2个致细胞病变的毒株,经RT-PCR和间接免疫荧光及电镜观察证实为BRVA,分别命名为HY-1株和QH-1株。蚀斑纯化的病毒滴度分别为108.39TCID50/ml（HY-1）和105.84TCID50/ml（QH-1）。自行设计基因组扩增引物,获得了2个分离株的全基因组。HY-1株基因组全长18474 bp,基因型为G6-P[11]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T6-E1-H1。QH-1株基因组全长18492 bp,基因型为G6-P[1]-I2-R2-C2-M2-A3-N3-T6-E2-H3。序列比对和系统发育树表明,HY-1株的VP1和VP3节段可能起源于羊,VP2,VP4,NSP1,NSP3基因可能起源于牛,VP6和VP7基因可能起源于反刍动物,NSP2、NSP4和NSP5基因可能起源于人。QH-1株VP1和VP3节段可能起源于羊,VP2,VP4,NSP1,NSP3,NSP5可能起源于牛,VP6和VP7基因可能起源于反刍动物,NSP2和NSP4基因可能起源于人。这两个基因组均显示出复杂的重配现象,且均含有2-3个人源的节段。氨基酸分析表明,与中国同型毒株相比,HY-1和QH-1株的VP4基因中VP8亚基区域分别发生了7处和20处氨基酸变化,其中QH-1株中有4处氨基酸变化发生在8-1和8-3区。同时在HY-1和QH-1株VP7基因的7-1和7-2区分别发生了9处和8处氨基酸变化。这些重要氨基酸位点的变化可能对毒株致病和免疫有影响,有待于进一步的实验验证。本实验首次获得了2个牦牛源BRVA的全基因组,对深入了解其分子特征和遗传进化提供了重要参考。鉴于这两个基因组均显示出复杂的重配现象,提示可能存在跨种间传播的能力,其公共卫生学意义值得进一步关注。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 牛A群轮状病毒VP4、VP7蛋白的结构与功能和分子分型应用
•   1.1 牛A群轮状病毒VP4 蛋白的结构与功能
•   1.2 牛A群轮状病毒VP7蛋白的结构与功能
•   1.3 牛A群轮状病毒分子分型方法的研究进展
•     1.3.1 巢式PCR方法
•     1.3.2 RT-PCR方法
•   1.4 牛A群轮状病毒的基因型流行情况研究进展
•     1.4.1 国外牛A群轮状病毒基因型分布情况
•     1.4.2 国内牛A群轮状病毒基因型分布情况
•   1.5 小结与展望
• 第2章 2017-2018 年青藏高原部分地区牦牛源A群轮状病毒的检测
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 临床样本
•     2.1.2 主要试剂及仪器
•     2.1.3 核酸提取和c DNA合成
•     2.1.4 RT-PCR检测
•     2.1.5 与冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒混合感染
•   2.2 结果
•     2.2.1 牦牛源BRVA的检测
•     2.2.2 牦牛源BRVA与冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 第3章 牦牛源A群轮状病毒VP4和VP7基因分子特征研究
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 临床样本及细胞系
•     3.1.2 主要试剂及仪器
•     3.1.3 临床样本的处理及接种
•     3.1.4 RNA的提取及c DNA合成
•     3.1.5 RT-PCR检测
•     3.1.6 VP4、VP7基因的扩增和分型
•     3.1.7 VP4和VP7基因遗传演化和重组分析
•   3.2 结果
•     3.2.1 RT-PCR检测
•     3.2.2 牦牛源BRVA VP4和VP7基因的扩增与分型
•     3.2.3 牦牛源BRVA VP4 基因片段的分析
•     3.2.4 牦牛源BRVA VP7基因片段的分析
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 第4章 牦牛源A群轮状病毒的分离鉴定和基因组研究
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 临床样本
•     4.1.2 主要试剂及仪器
•     4.1.3 病毒的分离
•     4.1.4 病毒的纯化及毒价测定
•     4.1.5 RNA提取和cDNA合成
•     4.1.6 病毒的鉴定
•     4.1.7 引物的设计与合成
•     4.1.8 牦牛源BRVA基因组的扩增
•     4.1.9 牦牛源BRVA基因组的遗传演化分析
•   4.2 结果
•     4.2.1 病毒的分离、纯化及毒价测定
•     4.2.2 病毒的鉴定
•     4.2.3 HY-1和QH-1株基因组的扩增和比对
•     4.2.4 HY-1株基因组分析
•     4.2.5 QH-1株基因组分析
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
• 结论及创新点
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李然

导师: 岳华

关键词: 牦牛,群轮状病毒,分子检测,分离,基因组

来源: 西南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西南民族大学

基金: “十三五”国家重点研发计划—牛羊重要病原体分子检测新技术研究(2016YFD0500907),四川省肉牛创新团队——现代繁殖技术研究与示范岗位团队四川省应用基础项目(2017JY0066)

分类号: S852.653

DOI: 10.27417/d.cnki.gxnmc.2019.000044

总页数: 87

文件大小: 2075K

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