导读:本文包含了四环素调控基因表达论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:基因,四环,细胞,病毒,尿激酶,转染,白蛋白。
四环素调控基因表达论文文献综述
张晟,黎海燕,廉梅,刘宇,肖东[1]（2019）在《基于四环素调控系统构建白蛋白启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体》一文中研究指出基于四环素调控系统构建白蛋白(albumin,Alb)启动子调控大鼠uPA(urokinase-type plasminogen activator,ruPA)转基因肝特异性过表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG)。以CTG0875-2-11质粒为模板,PCR扩增大鼠的uPA(ruPA)基因,3'端添加Flag标签,In-Fusion克隆至pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG)质粒中,得到慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG),所构建质粒经测序和酶切鉴定。将pLATTRUTG瞬时转染293T细胞,转染后24 h倒置荧光显微镜检测CopGFP表达;接着向6孔细胞培养板内加入强力霉素(Doxycycline,Dox),48 h后在倒置荧光显微镜下观察CopGFP表达(包括未加Dox的孔),随后收集细胞以提取总RNA和总蛋白,用于RT-qPCR检测ruPA及报告基因表达和Western blot检测标签蛋白Flag表达。酶切和测序确证我们成功构建了慢病毒载体pLATTRUTG;瞬转293T细胞后,24 h倒置荧光显微镜下可见零星细胞(约占0.1%)发弱的绿色荧光,加Dox 48 h后所有细胞展现强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然只见到零星细胞(约占0.1%)发弱的绿色荧光。RT-qPCR和Western blot检测结果显示,与不加Dox的细胞相比,加Dox的细胞中ruPA、报告基因CopGFP和Flag表达水平显着升高。结果提示,成功基于四环素调控系统构建Alb启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体pLATTRUTG,为相关后续实验奠定了基础。(本文来源于《动物医学进展》期刊2019年08期）
张航[2]（2018）在《四环素调控CGRP基因表达的腺相关病毒的构建及鉴定》一文中研究指出目的:构建含有四环素(Tetracycline,Tet)诱导调控降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)表达的重组腺相关病毒质粒,并包装9型重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated viral vector9,rAAV9),将其体外转染原代心肌细胞,观察重组腺相关病毒介导CGRP基因在原代心肌细胞中的表达。方法:1.pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒的构建以pAAV-TRE-CMV-tTS/rtTA为模版,PCR扩增并插入双酶切(Ba-mHI、ApaLI)和引入Myc尾的CGRP-Myc片段,再将双酶切后的片段连接构成重组腺相关病毒质粒pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA。2.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒的包装与鉴定将pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒与pAA-V9包装质粒、辅助质粒pHelper共同转染HEK293细胞,获得rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒。用SDS-PAGE测定病毒纯度和q-PCR法测定病毒滴度。3.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒表达的检测将重组腺相关病毒rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA体外转染乳鼠原代心肌细胞,并在细胞培养液中加入Dox诱导CGRP表达,提取mRNA和蛋白质,用RT-PCR法和WesternBlot法测定CGRP基因的表达水平。结果:1.成功构建pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒。2.成功包装rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒,病毒滴度为 1.87×1012GC/mL。3.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒成功转染原代心肌细胞,并在Dox诱导下介导CGRP基因高表达。结论:成功构建pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒,并包装和鉴定rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒。rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒成功转染原代心肌细胞并在Dox诱导下介导CGRP基因高表达。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2018-06-01）
尚冰清,周丹,朱宏,刘昱,郭丽丽[3]（2018）在《hsp90α基因四环素诱导调控表达质粒的构建及功能验证》一文中研究指出目的构建Hsp90α基因的单质粒四环素/强力霉素诱导表达系统,并验证其不同表达量对Hep G2肝癌细胞增殖的影响。方法通过PCR,分别从p Retro X-Tet-On Advanced质粒和pc DNA3.1-EGFP质粒中扩增rt TA表达盒和EGFP基因,依次将rt TA和EGFP基因克隆入p TRE-Tight载体中,p Retro X-Tight载体中,获得EGFP标记的Tet-on单质粒系统。基于本系统,构建DOX诱导的Hsp90α表达质粒p Retro X-Hsp90α-EGFPTet-On,然后采用脂质体转染Hep G2细胞,以不同浓度(0,100,500,2500 ng/m L)的DOX诱导,通过荧光显微镜、荧光定量PCR以及Western blot检测EGFP和目的蛋白Hsp90α的表达。结果转染质粒载体后的Hep G2细胞经不同浓度的DOX 24 h后,RT-PCR和Western blot结果显示一致,随着DOX浓度的增大,Hsp90α基因表达量逐渐增加,DOX 500 ng/m L时时,基因表达的水平达到高峰;加入DOX 48 h后,细胞的增殖明显高于对照组,且存在剂量依赖性。结论该研究成功地应用四环素基因表达调控系统调控了Hsp90α基因在HepG2细胞内表达及促肿瘤细胞增殖的功能,为进一步探讨Hsp90α基因与肿瘤的增殖和侵袭之间的关系提供理论基础。(本文来源于《中西医结合心血管病电子杂志》期刊2018年08期）
张娟[4]（2015）在《四环素调控人Numb基因过表达慢病毒载体的分步构建》一文中研究指出目的:本课题旨在构建含有四环素调控人Numb基因过表达调控组份的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒载体,以及构建含有四环素调控人Numb基因过表达反应组份的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒载体,并测定它们的滴度,为Numb调控人干细胞“干性”的研究提供实验基础。方法:1、采用酶切技术将Lenti-egfp-IRES-puro载体酶切后获得Lenti-IRES-puro骨架。采用凝胶电泳技术验证rtta基因片段。将rtta基因片段连接到Lenti-IRES-puro骨架上得到Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒。将重组质粒转入到感受态大肠杆菌中进行质粒的扩增,提取质粒通过酶切及基因测序验证后,将Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒、辅助包装质粒delta、pVSVG共转染293T细胞,分别在转染后48小时和72小时收集病毒及浓缩病毒。将病毒稀释后感染293T细胞,48小时后,通过ELISA方法测定其滴度。2、使用酶切技术将Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4载体酶切后获得Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架。使用RT-PCR技术从人胚胎干细胞总RNA中获得人Numb基因片段,将人Numb基因片段连接到Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架上得到Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒。将重组质粒转入到感受态大肠杆菌中进行质粒的扩增,提取质粒通过酶切及基因测序验证后,将Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒、辅助包装质粒delta、pVSVG共转染293T细胞,分别在转染后48小时和72小时收集病毒及浓缩病毒。将病毒稀释后感染293T细胞,48小时后,通过DAPI细胞染色方法测定其滴度。结果:1、Lenti-egfp-IRES-puro载体经酶切行琼脂糖凝胶电泳后,观察到有两条条带,显示Lenti-IRES-puro骨架获取成功。rtta基因片段行琼脂糖凝胶电泳后,观察到在1kbp附近有条带,显示rtta基因片段获取成功。克隆的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒经酶切行琼脂糖凝胶电泳,观察到有两条条带,经基因测序结果为100%正确,显示Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒构建成功。重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞,感染后48小时收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒浓缩液滴度为:6.5*10^7TU/ml,感染后72小时收集的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒浓缩液滴度为:5.7*10^7TU/ml。2、Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4载体经酶切后行琼脂糖凝胶电泳,观察到有两条条带,显示Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架获取成功。采用RT-PCR技术从人胚胎干细胞总RNA中获取人Numb基因片段行琼脂糖凝胶电泳后,观察到在2kbp处有条带,显示人Numb基因片段获取成功。克隆的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒经酶切后行琼脂糖凝胶电泳,观察到有两条条带,经基因测序结果为100%正确,显示Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒构建成功。重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞,感染后48小时收集的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb病毒浓缩液滴度为:3.5*10^7TU/ml,感染后72小时后收集的LentiEF1a-EGFP-TRE-Numb病毒浓缩液滴度为:2.5*10^7TU/ml。结论:1、含有四环素调控人Numb基因过表达调控组份的Lenti-EF1a-RTTA-IRE S-Puro慢病毒载体构建成功。2、含有四环素调控人Numb基因过表达反应组份的Lenti-EF1a-EGFP-TRENumb慢病毒载体构建成功。(本文来源于《南昌大学》期刊2015-05-29）
王茜,杜珍武,马青山,张桂珍[5]（2014）在《四环素调控HSV-tk基因在HeLa细胞内表达及抗肿瘤作用》一文中研究指出目的探讨应用四环素调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因在HeLa细胞内表达及抗肿瘤作用。方法将含有四环素阻遏蛋白基因的质粒载体pcDNA6/TR与含有四环素反应元件及HSV-tk基因的质粒载体pcDNA3.1-TetO2-TKI先后稳定转染HeLa细胞,给予不同浓度的四环素类似物强力霉素,应用RT-PCR检测细胞内HSV-tk基因表达,应用MTT法测定转染HSV-tk基因的HeLa细胞对不同浓度无氧鸟苷(GCV)杀伤的敏感性。结果转染两种质粒载体的HeLa细胞经不同浓度的强力霉素作用48h后,RT-PCR结果显示,随着强力霉素浓度的增大,HSV-tk基因表达量逐渐增加,强力霉素4μg/ml时,基因表达的水平达到高峰;加入强力霉素后,该细胞对GCV杀伤细胞的敏感性增加。结论本研究成功地应用四环素基因表达调控系统调控了HSV-tk基因在HeLa细胞内表达及杀伤肿瘤功能,为进一步探讨自杀基因杀伤肿瘤的可调控性提供理论基础。(本文来源于《中国实验诊断学》期刊2014年09期）
杜晓媛[6]（2013）在《四环素调控表达系统调节LEF1基因在成纤维细胞中的表达》一文中研究指出四环素(tetracycline, Tet)调控诱导表达系统是近年来发展起来的具有高效、严密开关功能的基因表达调控系统,诱导物是四环素或四环素衍生物,通过诱导物可以从时空角度上特异性地控制外源基因在转基因细胞和转基因动物中的表达。本实验应用Tet-on系统,构建四环素调控淋巴样生长因子基因(LEF-1)表达的表达载体,并与Tet-on系统中的诱导表达载体pcDNA6共转染绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞。通过四环素诱导来检测LEF1基因在mRNA水平的表达量。下图是对四环素诱导系统的简单介绍：四环素诱导调控表达系统主要包括调控表达载体pcDNA4和反应表达载体pcDNA6两种质粒。调控表达载体pcDNA4主要由启动子,操纵序列和目的基因组成；反应表达载体pcDNA6通过启动子表达阻遏蛋白TetR。将pcDNA4和pcDNA6两质粒通过共转染的方法转染体外培养的细胞后,pcDNA6载体表达的阻遏蛋白TetR与表达载体pcDNA4上的操纵序列结合,阻遏了目的基因的表达。当细胞培养液中四环素Tet或四环素衍生物强力霉素(DOX)存在时,可与pcDNA4的操纵序列结合,从而引起阻遏蛋白TetR构想发生变化,从操纵序列上脱落下来,最终诱导目的基因的转录。1LEF1基因毛囊特异性表达载体pcDNA4-KL的构建本研究应用四环素调控诱导表达系统,以系统中的调控表达载体pcDNA4为基本骨架,选用角蛋白关联蛋白KAP6.1基因启动子为构建最终表达载体的启动子,启动目的基因淋巴样生长因子LEF1基因。KAP6.1基因启动子片段及LEF1基因片段的获得是通过PCR扩增法,分别以现有的表达载体pcDsRed2-KV和载体pCDsRed2-KL为模板,使用LA TAq DNA聚合酶合成相应片段。将四环素调控表达系统中的表达载体pcDNA4/TO通过相应限制性内切酶酶切,以及T4连接酶将目的片段连接后,得到的新的载体为修改后的载体,与原pcDNA4/TO载体相比,删除了部分序列。然后用PCR扩增出的角蛋白关联蛋白KAP6.1基因启动子片段替换载体中的原始启动子CMV片段,淋巴样生长因子I(LEF1)片段插入修改后的表达载体pcDNA的多克隆位点(MCS)。实验在构建载体pcDNA4-KL的过程中,角蛋白关联蛋白KAP6.1基因启动子与pMD19T连接,重组质粒经过限制性内切酶酶切电泳,发现片段大小及连接都正确。从而可以进一步检测片段序列,更好行驶基因功能,发挥在载体上的作用。挑选重组质粒并编号委托上海生工生物有限公司测序,应用生物专用软件genebank,查找LEF1基因序列,与测序结果相比对,结果证明正确。淋巴样生长因子I(LEF1)片段的检测与KAP6.1启动子片段一样,结果证明也正确。将测序正确的pMD19-TK与修改后的pcDNA4两质粒用NdeI和MluI两限制性内切酶双酶切后,用T4连接酶连接相应的目的片段,经过酶切鉴定KAP6.1基因启动子片段正确连入载体pcDNA4启动子区域,得到载体pcDNA4-K。BamHI和EcoRI两限制性内切酶双酶切pMD19T-L和pcDNA4-K, T4连接酶连接相应的目的片段,经酶切鉴定LEF1基因片段正确插入载体pcDNA4-K的MCS位点上。为下一步与四环素调控表达系统中的表达载体pcDNA6共同转染细胞奠定了基础。2胎儿皮肤成纤维细胞培养及共转染在体外分离培养胎儿皮肤成纤维细胞,并且进行双载体共转染细胞实验。配置含有10%FBS的DMEM/F12的细胞培养液,培养原代胎儿皮肤成纤维细胞,于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养；当细胞生长铺满整个培养皿后,冷冻保存细胞。配置细胞冷冻保存液,即10%DMSO+90%FBS。利用脂质体Lipoftaecmine TM介导法,将表达载体pcDNA4-KL和诱导表达载体pcDNA6共转染绒山羊第二代胎儿成纤维细胞,用合适的抗生素Blasticidin和博莱霉素Zeocin两种抗生素浓度共同筛选细胞,筛选12后得到单克隆细胞。0.25%胰酶消化单克隆细胞扩大培养,待细胞长满整个皿后,提取其基因组DNA,进行PCR鉴定。Blasticidin浓度为13μg/ml及Zeocin浓度为1500μg/ml的两种抗生素共同筛选12天,获得单克隆细胞。利用克隆杯胰酶消化法,将单克隆细胞扩大培养,用普通基因DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA,经PCR扩增电泳鉴定表达载体pcDNA4-KL已与细胞基因组稳定整合,同时表达载体pcDNA6与细胞基因组也稳定整合。可以进行下一步的四环素诱导及检测。3四环素诱导目的基因LEF1在皮肤成纤维细胞中的表达设置诱导物四环素(Tet)在不同浓度(0ug/ml,1ug/ml,10ug/ml,20ug/ml)下,对转有毛囊特异性表达载体pcDNA-KL和诱导表达载体pcDNA6的转基因细胞,于10%FBS+DMEM/F12培养液、37℃、5%CO：、饱和湿度条件下进行培养诱导。24h后,提取不同四环素诱导下的细胞RNA,经过反转录成cDNA,通过实时方法来检测淋巴样增强因子(LEF1)在mRNA水平上的表达,确定四环素的最佳浓度。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2013-04-01）
翟登月,魏宁,朱幼玲,吴波娜,姜永军[7]（2011）在《四环素调控复制缺陷性疱疹病毒载体介导LacZ基因在原代培养神经元中的表达》一文中研究指出目的利用四环素调控复制缺陷性单纯疱疹病毒I型重组载体(QR9TO-LacZ)感染体外原代培养的大鼠皮层神经元,探讨其介导半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达情况及基因调控效能;并检测该载体对神经元活力的影响。方法用RUL9-8细胞系扩增QR9TO-LacZ病毒株,收集后采用噬斑法测定病毒滴度;体外原代培养大鼠皮层神经元。将培养的原代神经元分为强力霉素(DOX)组和对照组。两组细胞均用QR9TO-LacZ转染,强力霉素组加入四环素衍生物强力霉素(0.5μg/ml),对照组加入等剂量空白对照液。同时根据感染复数(MOI),即MOI=3、5、10、30 PFU/cell,将两组培养细胞进一步分为亚组。病毒转染48h后行X-gal染色;光镜下观察神经元形态,随机选取10个高倍镜视野(×400),计算每高倍镜视野中平均蓝染细胞率,比较不同MOI病毒感染神经元的效率。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测感染病毒48 h(MOI同上)后神经元的活性。结果在含有DOX的培养环境中,不同MOI亚组(3、5、10、30 PFU/cell)QR9TO-LacZ感染神经元出现蓝染细胞百分比分别为5.35%±0.84%、10.64%±1.92%、19.73%±2.87%、34.41%±2.58%;在无DOX的培养环境中,各亚组均未观察到蓝染细胞。上述MOI感染的神经元细胞存活率分别为:90.24%±8.16%、88.00%±5.69%、83.95%±3.82%、78.90%±5.49%。结论 QR9TO-LacZ载体能有效地将目的基因导入原代培养神经元中并表达;目的基因表达的开启受强力霉素调控;QR9TO-LacZ对体外原代培养神经元毒性较低。(本文来源于《临床和实验医学杂志》期刊2011年22期）
梁丽,雷宇,倪艳,王蜀强,彭凤英[8]（2011）在《HBV-S基因四环素调控双表达载体的构建及其调控表达研究》一文中研究指出目的:构建在同一载体中含乙肝病毒表面抗原基因(Hepatitis B virus surface gene,HBV-S)和四环素阻抑蛋白基因的双表达载体,研究在真核细胞中四环素对S基因表达的调控。方法:在双表达载体pVITRO3一个启动子后的多克隆位点插入四环素阻抑蛋白基因,用含四环素操纵子的启动子取代另一个启动子,并在其多克隆位点插入S基因,在同一载体中构建成S基因的四环素调控表达系统。用脂质体将重组质粒转染HepG2细胞,潮霉素400μg/ml进行抗性筛选,20 d形成抗性克隆,建立在四环素诱导下能稳定表达S基因的细胞系。以不同浓度的四环素(0.5、1.0、2.0、3.0μg/ml)进行诱导,用逆转录PCR和微粒子酶免疫分析法检测S抗原的表达,以确定四环素的最佳浓度。结果:转染了重组质粒的HepG2细胞,在无四环素环境下,表达HBsAg水平极低,72 h时S/N值平均为1.57,在不同浓度的四环素诱导下,HBsAg表达量明显增加,72 h时S/N平均值分别为4.24、4.23、4.18、4.20,未发现与四环素的浓度之间有剂量关系。结论:成功构建了在同一质粒中表达HBV-S基因和四环素阻抑蛋白基因的双表达调控载体,在不同浓度四环素诱导下均有HBsAg表达,并随时间延长而表达量增高,但在同一时间点无明显差异。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2011年07期）
王茜[9]（2009）在《四环素调控HSV-tk基因表达及体外杀伤肿瘤细胞的研究》一文中研究指出单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因是肿瘤基因治疗研究中常用的自杀基因,为达到安全有效的治疗目的,需要调控HSV-tk基因在肿瘤细胞内精确地表达,从而防止基因过表达对机体产生危害,低表达影响治疗效果。本研究利用基因重组技术构建了四环素调控HSV-tk基因表达的双质粒载体系统,在此基础之上又构建了四环素调控HSV-tk基因表达的单质粒载体系统。体外细胞水平研究结果表明构建的四环素调控HSV-tk的双载体系统可有效调控HSV-tk基因在宫颈癌HeLa细胞表达及抗肿瘤活性;构建的四环素调控HSV-tk的单载体系统可有效地调控HSV-tk基因在HeLa细胞及结肠癌HCT-8细胞内表达,并可调控其抗肿瘤活性.本研究构建的四环素单质粒基因表达调控系统与四环素双质粒基因表达调控系统比较,具有基因转染操作简便、节省时间和经济成本等优点;同时单质粒调控系统是一个自我调节基因表达的调控载体,能使HSV-tk基因有一定的基础表达,比双载体系统启动基因表达所需时间短、强力霉素所需浓度低,以及调控基因表达时间长。这些特点使其更适用于肿瘤的基因治疗。本研究成功构建了四环素调控HSV-tk基因表达的双载体系统及单载体系统,为进一步提高HSV-tk基因肿瘤治疗的安全性及有效性奠定了实验基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2009-05-01）
王茜,杜珍武,赵虹,张桂珍[10]（2009）在《四环素基因表达调控系统调控HSV-tk基因表达的单载体构建》一文中研究指出目的构建能够调控自杀基因表达的单载体四环素基因表达调控系统。方法以真核表达载体pcDNA3.1为载体构建骨架,将两个四环素基因表达调控元件(TetO2)克隆到pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体;将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)与核糖体进位位点(IRES)相连的基因片段克隆入pcDNA3.1-TetO2载体的多克隆酶切位点,构建成pcDNA3.1-TetO2-HSV-TK-IRES载体;将四环素调控子基因(TR)克隆至pcDNA3.1-TetO2-HSV-TK-IRES载体IRES下游,从而构建成pcDNA3.1-TetO2-HSV-TK-IRES-TR载体。利用酶切与测序鉴定克隆结果。结果载体构建过程的酶切结果以及测序结果表明载体构建正确。结论成功构建了能够调控自杀基因表达的单载体四环素基因表达调控系统,为调控自杀基因体外杀伤肿瘤奠定实验基础。(本文来源于《中国老年学杂志》期刊2009年07期）
四环素调控基因表达论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:构建含有四环素(Tetracycline,Tet)诱导调控降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)表达的重组腺相关病毒质粒,并包装9型重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated viral vector9,rAAV9),将其体外转染原代心肌细胞,观察重组腺相关病毒介导CGRP基因在原代心肌细胞中的表达。方法:1.pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒的构建以pAAV-TRE-CMV-tTS/rtTA为模版,PCR扩增并插入双酶切(Ba-mHI、ApaLI)和引入Myc尾的CGRP-Myc片段,再将双酶切后的片段连接构成重组腺相关病毒质粒pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA。2.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒的包装与鉴定将pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒与pAA-V9包装质粒、辅助质粒pHelper共同转染HEK293细胞,获得rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒。用SDS-PAGE测定病毒纯度和q-PCR法测定病毒滴度。3.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒表达的检测将重组腺相关病毒rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA体外转染乳鼠原代心肌细胞,并在细胞培养液中加入Dox诱导CGRP表达,提取mRNA和蛋白质,用RT-PCR法和WesternBlot法测定CGRP基因的表达水平。结果:1.成功构建pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒。2.成功包装rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒,病毒滴度为 1.87×1012GC/mL。3.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒成功转染原代心肌细胞,并在Dox诱导下介导CGRP基因高表达。结论:成功构建pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒,并包装和鉴定rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒。rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒成功转染原代心肌细胞并在Dox诱导下介导CGRP基因高表达。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
四环素调控基因表达论文参考文献
[1].张晟,黎海燕,廉梅,刘宇,肖东.基于四环素调控系统构建白蛋白启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体[J].动物医学进展.2019
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