周亮董彦鹏孙亮武林鑫张朝宾王稳
北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院麻醉科北京１０００２１通信作者:孙莉,医学博士,北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院麻醉科,麻醉与镇痛专业,主任医师
【摘要】目的探讨不同剂量丁丙诺啡联合吗啡治疗大鼠骨癌痛的效果及机制.方法选择成年雌性Wistar大鼠６４只,,随机分为８组(n＝８),即空白对照组(C组)、吗啡１０mg/kg组(M组)、吗啡１０mg/kg＋丁丙诺啡２０ug/kg组(MB１组)、吗啡１０mg/kg＋丁丙诺啡４０ug/kg组(MB２组)、吗啡１０mg/kg＋丁丙诺啡６０ug/kg组(MB３组)、丁丙诺啡５０ug/kg＋丁丙诺啡２０ug/kg组(BB１组)、丁丙诺啡５０ug/kg＋丁丙诺啡４０ug/kg组(BB２组)、丁丙诺啡５０ug/kg＋丁丙诺啡６０ug/kg组(BB３组),分别于每日７:００am和７:００pm进行皮下注射,连续８日,每日７:００pm给药后３０min进行疼痛行为学测定即甩尾实验,Westen－blot测定中枢神经系统阿片受体的表达情况.结果给药第７、８日,甩尾实验,MB１,MB２组较M组,抗伤害痛阈升高;MB１MB２组较M组,PAG和LC以及腰段脊髓MOR的上调以及LC和腰段脊髓KOR的下调.结论低剂量丁丙诺啡延缓骨癌痛大鼠吗啡耐受,可能通过抑制PAG和LC以及腰段脊髓MOR的下调以及LC和腰段脊髓KOR的上调来实现.【关键词】丁丙诺啡;吗啡耐受;骨癌痛;阿片受体【Abstract】ObjectiveToexplorethetherapeuticeffectsandmechanismofdifferentdosesofbuprenorphinecombinedwithmorphineforbonecancerpaininrats．MethodsSixty－fouradultfemaleWistarrats,weighing１６０－２００g,wererandomlypidedinto８groups(n＝８each):morphine１０mg/kggroup(groupM),morＧphine１０mg/kg＋buprenorphine２０ug/kggroup(groupMB１),morphine１０mg/kg＋buprenorphine４０ug/kggroup(groupMB２),morphine１０mg/kg＋buprenorＧphine６０ug/kggroup(groupMB３),buprenorphine５０ug/kg＋buprenorphine２０ug/kggroup(groupBB１),buprenorphine５０ug/kg＋buprenorphine４０ug/kggroup(groupBB２),buprenorphine５０ug/kg＋buprenorphine６０ug/kggroup(groupBB３)andcontrolgroup(groupC)．Morphineand/orbuprenorphineweresubcutaneouslygiventwiceaday(at７:００amand７:００pm,respectively)for８consecutivedays．andallratsunderwentafterAntinociceptionwasdeterminedbytailflicklantency(TFL)tohotwaterat(５２±０．５)℃．TFLwasmeasuredat７:３０pmforthe８consecutivedays．Westen－blotanalysiswasusedtoexaminetheexpressionofopioidreceptors??proteinincentralnervesystem．ResultsTail－flicklatencyofgroupMB１andgroupMB２islongerthanthatofgroupMandgroupC(P＜０．００１)．MORproＧteinandDORproteininPGweredown－regulatedwhileMOR??S,KOR??sandDOR??SproteininLCandlumbosacralspinalcordwereup－regulatedingroupM．TheproteinofMORwasup－regulatedinPAGofbothgroupMB１andgroupMB２．TheproteinofKORwasdown－regulatedinPAGandlumbosarcralspinalcordofgroupMB１comparedwiththoseingroupM(P＜０．００１)．ConclusionSystemicadministrationoflowerdosebuprenorphinecanpreventmorphinetoleranceanddeＧcreasetheanalgesiceffectofmorphinewhichmaybecausedthroughchangesofopioidreceptorsinPAGandlumbarspinalcord．【Keywords】Opioidreceptor,Buprenorphine,Morphinetolerance,Bonecancer【中图分类号】R９６２．２【文献标识码】B【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－１１４１－０３
背景三分之一的进展期癌症患者在疾病发展过程中,均会出现骨骼转移[１].尤其是在乳腺癌、前列腺癌、肺癌患者较为常见[２].临床上吗啡常用来治疗骨癌痛,但是反复应用导致的吗啡耐受限制了其应用[３].吗啡是阿片受体激动剂,通过作用于中枢以及外周的μ(MOR),κ(KOR)和δ(DOR)阿片类受体而发挥镇痛作用,主要作用于MOR.近年来关于吗啡耐受的神经病理机制一直受到临床医生与研究人员的关注,但仍无明确结论.吗啡耐受的机制十分复杂,各种不同且不相关的机制参与其中,是多种通路共同作用的结果.阿片受体主要存在于中脑导水管周围灰质PAG、丘脑、蓝斑LC、脊髓背角等部位,在阿片药物各种作用及吗啡耐受机制研究中,对阿片类受体本身及各部位的阿片受体之间的关系的研究仍是非常重要的研究内容.包括对受体种类,受体密度,各受体之间的作用以及受体基因等研究[３－５].近年来,研究发现通过联合多种药物均可能延缓或减轻吗啡耐受,如NMDA受体拮抗剂[６]、NOS受体抑制剂[７]、小剂量的阿片受体拮抗剂[８]等,联合用药可以达到更好的镇痛效果并减少副作用的发生.相较于阿片耐受出现后如何减轻而言,通过联合用药来预防或延缓耐受的出现显得更为重要.
阿片受体激动/拮抗剂包括丁丙诺啡、喷他佐辛和地佐辛等,是在临床麻醉与疼痛治疗中广泛应用的一类阿片类药,但一直以来,阿片受体激动剂抗剂与其它阿片类药物受体激动剂联合应用的临床效果一直存在较大的争议.Yekkirala[９]等研究认为阿片受体激动－拮抗剂喷他佐辛与吗啡联合应用时,喷他佐辛可拮抗吗啡对于MOR的激活,削弱其镇痛作用.而Aurilio等经临床观察发现同为阿片受体激动－拮抗剂的丁丙诺啡与吗啡联合应用时却可发挥镇痛的协同效应.丁丙诺啡作为阿片受体激动剂－拮抗剂的代表药物[１０,１１],广泛用于临床镇痛治疗,在某些情况下优于其他阿片类药物[１２,１３].同时丁丙诺啡常被用于戒断及情感障碍等非说明书适应症方面的治疗,效果确切[１４－１６].在我们的临床工作中,我们发现硫酸吗啡缓释片与丁丙诺啡舌下含服片联合治疗进展期癌痛患者,可以增强止痛效果,减少副作用以及提高患者的生活质量.我们推论这些现象与阿片受体激活水平有关,而具体机制与原因亟待深入研究.
综上所述,目前关于阿片类药物激动剂吗啡与阿片类药物激动－拮抗剂丁丙诺啡联合应用治疗疼痛的研究结论尚不完全一致,尤其是对于骨癌痛治疗方面的研究报道较少,且多属临床研究,缺乏对其作用机制的深入讨论.本研究通过建立大鼠骨癌痛模型,观察两种药物联合应用对骨癌痛大鼠的镇痛效果以及药物耐受出现的时间,并通过对阿片受体表达水平的检测,在受体水平阐述联合二药治疗癌痛的作用机制,为临床合理选择联合应用阿片类药物治疗癌痛提供可靠的参考数据.材料与方法
动物动物实验已通过本院伦理委员会的审批,选择体重１６０－２００g雌性Wistar大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)用于该实验.所有大鼠均严格按照国家部属实验动物管理委员会制定的实验动物环境条件标准进行饲养.实验开始前每天将大鼠称重一次,连续３天,以减轻或排除因捉拿而引起的应激反应;并对大鼠进行痛阈筛选,痛反应时间超过平均值±３倍标准差的大鼠剔除.根据预实验的结果,大鼠骨癌痛模型建立成功率为９０％,本研究如后所述需骨癌痛大鼠６４只,因此共需要７２只.
细胞系将０．５ml的Walker２５６大鼠乳腺癌细胞(２×１０７/ml)注入大鼠腹腔中培养一周,一周后收集腹水３ml,用０．９％的氯化钠溶液将腹水稀释至２×１０７/ml细胞悬液,以供注射.大鼠胫骨癌痛模型制备骨癌痛大鼠苯巴比妥麻醉(６５mg/kg)后仰卧捆绑,在左侧胫骨下１/３处做一小切口,切开皮肤,分离肌肉,暴露胫骨下１/３前内侧,使用１０ml注射器针头于骨膜处穿刺打孔,采用１０ul注射器进入骨髓腔１cm,注射１０ul预先制备的Walker２５６细胞(２×１０５),注射后在骨髓腔内停留２min,然后拔出注射器以骨蜡封闭针孔,清洗、缝合伤口,将大鼠送回饲养笼.对模型进行评估
观察防御时间,术后第１、３、５、７、９、１１、１３、１５天,将大鼠放在实验台上自由步行２min,记录后腿抬起的时间,正常抬起时间为０－２s,若增加至８－１６s,则造模成功可用于实验.影像学检查为观察肿瘤生长和骨质结构破坏程度,在术后１５天对大鼠左侧胫骨进行X线检测,观察骨质破坏情况.组织学检查为证明大鼠胫骨骨癌痛模型制作成功,在测定疼痛行为学后,处死大鼠,取左后肢行石蜡包埋、切片、HE染色,镜下观察肿瘤细胞生长和骨结构的破坏情况.
实验分组与给药方案大鼠骨癌痛模型建立后第１５天,选取造模成功大鼠６４只,将其分为８组,每组８只,分别于每日７:００am和１９:００pm进行皮下注射,连续８日.Control(空白组);M组(吗啡组);MB１组(吗啡＋丁丙诺啡２０ug/kg);MB２组(吗啡＋丁丙诺啡４０ug/kg);MB３组(吗啡＋丁丙诺啡６０ug/kg);BB１组(丁丙诺啡５０ug/kg＋丁丙诺啡２０ug/kg);BB２组(丁丙诺啡５０ug/kg＋丁丙诺啡４０ug/kg);BB３组(丁丙诺啡５０ug/kg＋丁丙诺啡６０ug/kg)
疼痛行为学测定全部大鼠于建模第１５天开始,每日下午给药后３０min进行疼痛行为学测定,即大鼠甩尾实验,由对实验分组未知的实验人员实施.抗伤害阈值测定甩尾实验利用盒子固定实验大鼠,测定其尾巴对热水刺激的甩尾反应,按基础甩尾时间为４±０．５s,设定水浴箱温度,约为(５２±０．５)℃,大鼠尾部置入水浴箱长度约为３cm,切断时间设定为１２s．Westen－Blot检测大鼠不同部位神经组织中μ,κ和δ受体的蛋白表达.蛋白提取:将神经组织块匀浆器中将组织块尽量剪碎,加入３００ul全细胞蛋白裂解液于匀浆器中,进行匀浆,之后置于冰上,再重新碾碎几次.样品裂解３０min后,即可将裂解液移至离心管中,然后在４℃下以１２０００rpm离心５min,取上清分装于离心管中并置于－２０℃条件下保存.蛋白含量测定:利用Bradford方法测定蛋白浓度.配制１２％SDS－PAGE胶.
各组样品取细胞总蛋白５０µg,分别loadingBuffer混匀,９５℃水浴处理５min．各组样品取细胞总蛋白５０µg,分别用５×SDS上样缓冲液于离心管中混匀,进行还原变性处理.用微量进样器贴壁吸取样品,加入上样孔后,７４V恒压电泳４０min．转印.转印结束后,取膜,用TBS/T缓冲液漂洗,转移到一干净的大小合适的平皿中,加入３％的BSA/TBS封闭液,将膜覆盖,４℃条件下过夜.去除封闭液,用TBS/T缓冲液漂洗两次,加入受体多克隆抗体,孵育１小时.之后室温下脱色摇床上洗３次.移去受体多克隆抗体.将膜移入干净平皿中,加入IgG,室温摇床,孵育１小时,移去IgG.用ECL化学发光剂对膜进行显色,而后在暗室内进行曝光、显影、定影.统计学方法:用SPSS１３．０软件进行统计学分析,数据采用均数±标准差表示,行为学检测,组内比较采用２－wayANOVA,组间Tukey??stest,P＜０．０５为差异有统计学意义.结果１热痛阈大鼠甩尾实验结果见下图１
??,与空白组相比差异有统计学意义,P＜０．０５;◆吗啡组与MB３组腰段脊髓的μ和δ受体的表达水平明显下调(P＜０．０５)◆MB１、MB２组与吗啡组相比,μ和δ受体水平明显增高(P＜０．０５)◆与对照组相比,吗啡组与MB３组κ受体表达水平上调(P＜０．０５)◆MB１、MB２组与吗啡组相比,κ受体表达水平下降(P＜０．０５)
讨论:本实验对丁丙诺啡联合吗啡治疗大鼠骨癌痛过程中所出现吗啡镇痛耐受的情况及其中枢神经系统阿片类受体表达情况进行研究.本研究发现,低剂量丁丙诺啡联合吗啡可以明显延缓吗啡耐受的出现,而高剂量组没有出现类似的情况,即表现为热痛阈大鼠甩尾时间D７－８(MB１,MB２VS．M,P＜０．００１;MB３VS．M,P＞０．０５).另外尽管使用丁丙诺啡＋丁丙诺啡实验组与空白组相比显示出一定镇痛效果,且可以看出镇痛效果与丁丙诺啡剂量呈正相关,但其镇痛效果远差于单独使用吗啡组及吗啡联合丁丙诺啡组,而且较早出现耐受,结果如下,D１－３(BB３与M,MB１,MB２,MB３各组间无统计学差异,P＞０．０５;BB１,BB２VS．Control;BB１,BB２VS．MP＜０．０５);D４－８(BB１,BB２VS．Control,P＞０．０５);D４－６(BB３VS．Control;BB３VS．MP＜０．０５).这些足以证明丁丙诺啡并不是通过简单的剂量累加增加吗啡的镇痛效果而延长镇痛时间.正因为这些,我们可以认为低剂量的丁丙诺啡确实是通过延缓吗啡耐受的出现,进而延长了吗啡的镇痛时间.
我们通过Western－Blot技术发现各组实验大鼠中脑导水管周围灰质、蓝斑以及腰段脊髓不同阿片受体蛋白质的表达也存在差异.长期应用吗啡可以产生耐受,其机制较为复杂,包括阿片受体的改变[１７－２０]、NMDA受体的激活[２１,２２]、氧化应激与硝化应激[２３,２４]、神经胶质细胞改变[２５]、代谢异常和遗传易感性等病理生理学机制.其中阿片受体的改变是吗啡耐受机制的重要组成部分,目前为止,吗啡耐受中阿片受体的作用尚无定论.吗啡主要通过作用于MOR而发挥镇痛作用,但是MOR对于吗啡耐受形成的作用尚存争议,MOR的上调、下调、脱敏感和内生化均可能与吗啡耐受有关[２５－２７].MOR与激动剂结合后,发生磷酸化及去敏感化,激活下游信号因子和通路,当与激动剂脱离时,受体内吞,去磷酸化重新恢复敏感,吗啡耐受时,MOR可能发生去磷酸化障碍,敏感性下降,这也是影响吗啡耐受的重要机制之一[２８,２９].同时KOR和DOR在耐受中也起着一定作用[３０],KOR的表达改变[３１]、MOR与DOR的特定相互作用等在吗啡耐受的形成和发展中也起到一定作用[３２].此外,吗啡耐受时,中枢及外周的不同部位的不同阿片受体表达变化也是存在差异的[３３].本研究中,吗啡组大鼠于给药第六天开始出现热痛阈值的持续下降,表明出现了耐受.吗啡组大鼠PAG、LC与腰段脊髓的阿片受体表达检测结果显示,吗啡耐受时,PAG区MOR和DOR的蛋白表达明显下降;LC区中MOR的表达水平明显下调(P＜０．０５);腰段脊髓的MOR和DOR的表达水平明显下调(P＜０．０５),与对照组相比,κ受体表达水平上调(P＜０．０５).阿片受体密度的改变是引起吗啡耐受的重要病理生理学机制[３３,３４].本课题组前期研究发现,吗啡耐受可能是多个区域不同阿片受体共同改变的结果,吗啡耐受时,大鼠中枢神经系统不同部位的阿片受体表达变化不同,而PAG区的MOR和DOR表达协同下调.但是,Horvath等人应用激光共聚显微镜观察大鼠脊髓背角的MOR,发现吗啡耐受时大鼠脊髓背角MOR表达明显上调,通过抑制P２X４受体减轻吗啡耐受后,脊髓背角的MOR表达上调降低,这与本研究结果不一致[３５].
而更为重要的是,本研究发现小剂量丁丙诺啡与吗啡联合应用时,即MB１、MB２组大鼠PAG、LC以及腰段脊髓阿片受体表达结果显示,大鼠PAG区MB１、MB２组与吗啡组相比,μ和δ受体水平明显增高(P＜０．０５);LC区与吗啡组相比,MB１、MB２组μ受体水平明显增高(P＜０．０５),κ受体表达水平明显降低(P＜０．０５);腰段脊髓MB１、MB２组与吗啡组相比,μ和δ受体水平明显增高(P＜０．０５),κ受体表达水平下降(P＜０．０５),这与以往研究[４]所观察到的结果一致.因此本研究发现小剂量丁丙诺啡可以减轻吗啡耐受的发生,可能是通过抑制吗啡耐受时PAG和LC以及腰段脊髓MOR的下调以及LC和腰段脊髓KOR的上调而达到作用.同时PAG区和腰段脊髓中δ受体水平明显增高也可能是延缓吗啡耐受的机制之一.既往文献已经报道小剂量的丁丙诺啡表现出阿片受体的激动性,而大剂量的丁丙诺啡则反之表现为拮抗特性,同时发现小剂量丁丙诺啡对MOR和KOR表现出更强的亲和力,而且丁丙诺啡具有一旦结合受体解离速度慢的特性,尤其是对KOR[３６],故我们推测可能正是由于小剂量的丁丙诺啡与KOR的结合且慢解离,激活KOR可以抑制MOR的脱敏,加速MOR细胞内循环,使细胞表面受体增加,同时降低PKC的活性,从而抑制吗啡的镇痛耐受[３１].
同时在中枢神经系统受体表达方面,呈现出实验所出现结果.而本实验不足之处,就是在MB１组和MB２组表现出相似的疼痛抑制效果,两组间差异无统计学意义,在后续实验中应该进一步细化分组,直至发现可以延缓吗啡耐受之丁丙诺啡的最低有效剂量,从而为临床工作提供更为准确的依据;同时发现中枢系统受体表达的相关情况,进一步明确疼痛耐受以及延缓耐受的分子生理机制.当然关于丁丙诺啡的镇痛与促痛作用,延缓吗啡耐受与加速吗啡耐受到目前为止仍无肯定的结论,正如ElzbietaP[３７]等研究发现,高剂量的丁丙诺啡具有镇痛作用,而超低剂量的丁丙诺啡却具有促进痛觉敏感出现的作用,而这些差异的出现可以肯定的说与丁丙诺啡的剂量相关,而剂量的问题则间接反映了阿片受体数量以及密度的作用,而我们所掌握的关于丁丙诺啡剂量使用的知识还十分有限,再加上阿片受体之间也会相互作用,互相影响,故关于阿片药物耐受的研究,我们所需要的做的工作还很多.
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