论文摘要
【目的】构建登革病毒4型Ban18HK20株的感染性克隆,建立稳定的登革病毒（DENV）反向遗传学平台,以期探索登革病毒毒力关键基因,构建登革病毒减毒株;以Ban18HK20株为骨架构建登革嵌合病毒rDENV4/2,为研发登革热疫苗奠定基础。【方法】首先,根据登革病毒4型Ban18HK20株基因组序列设计特异引物,将病毒全长cDNA分6段进行亚克隆构建,再将其逐一拼接连入高拷贝质粒pSPTM中。通过筛选多种感受态细胞、改变培养条件来克服病毒基因组的细菌毒性,获得稳定的病毒全长cDNA感染性克隆pSPTM-DENV;以其为模板体外转录RNA,将RNA电转染Vero细胞,拯救获得恢复性病毒Ban18HK20。其次,采用同源重组克隆技术将登革病毒Ban18HK20中与其亲代毒株Ban18差异的氨基酸位点进行单点或联合多点回复突变为Ban18株的相应基因,利用DENV反向遗传学平台拯救获得回复性突变病毒。最后,采用融合PCR及同源重组技术,以DENV2型16681株病毒的prM-E基因取代感染性克隆pSPTM-DENV质粒中的相应基因片段,构建嵌合质粒pSPTM-DENV4/2,体外转录为RNA,再电转染Vero细胞,拯救获得登革嵌合病毒rDENV4/2。对拯救获得的恢复性病毒Ban18HK20、回复性突变病毒、嵌合病毒rDENV4/2,采用病毒蚀斑法、间接免疫荧光法、生长动力学实验、小鼠脑内神经毒力实验等进行了生物学特性鉴定;采用基因测序对恢复性病毒Ban18HK20及嵌合病毒rDENV4/2的遗传稳定性进行了研究;研究了登革嵌合病毒rDENV4/2在小鼠体内的免疫原性及免疫保护效果;同时,采用猴体模型,对登革嵌合病毒rDENV4/2和登革病毒4型Ban18HK20株的安全性进行了研究。【结果】成功构建了Ban18HK20感染性克隆pSPTM-DENV。电转染Vero细胞后,获得的第一代恢复性病毒滴度可高达6.3 lg PFU/mL。恢复性病毒在蚀斑形态、病毒E蛋白表达、生长特征、小鼠脑内神经毒力以及全基因序列等生物学特性方面同母本Ban18HK20株一致,且遗传特性稳定。基因分析比对发现登革病毒Ban18HK20株与其亲代病毒Ban18株全基因组中存在3个氨基酸和1个非编码区核苷酸位点的差异。采用反向遗传学技术,将登革病毒BanHK20株中4个差异基因单点或多点联合回复突变为Ban18的相应基因,获得了稳定的回复突变感染性克隆质粒,拯救获得了回复性突变病毒。基因序列分析鉴定正确。E155位点回复性突变病毒蚀斑边缘清晰,其余回复性突变病毒蚀斑形态与Ban18HK20相似,边缘模糊;多点联合突变病毒复制效率较低,而单点突变病毒均表现出与Ban18HK20相似的生长特性;回复性突变病毒rDENV1（E155）、rDENV3（E155&E369）和rDENV6（E155&E369&C111&3’UTR219）均对小鼠表现出较强毒力,lg(PFU/LD50)分别为0.1、0.4和1.1,小鼠平均存活时间分别为7.8d、8.1d和8.1d,而其余回复性突变病毒对小鼠表现出低神经毒力。成功构建并拯救获得了登革病毒2型16681株嵌合入登革病毒4型Ban18HK20株的嵌合病毒rDENV4/2。嵌合病毒可形成与登革病毒2型16681株相似的小蚀斑,明显不同于Ban18HK20株的大斑形;嵌合病毒rDENV4/2在Vero细胞上培养的最适MOI为0.01,病毒于感染后第4天达到滴度高峰,其生长曲线与两母本病毒相近,但在C6/36上的病毒滴度则稍低于两母本病毒;嵌合病毒rDENV4/2在Vero细胞连续传10代显示出其遗传稳定性;对小鼠不致病,对乳鼠有一定神经毒力;嵌合病毒（7.0 lgPFU）腹腔免疫小鼠2次后,可在初免后第6周产生相对较高的抗DENV-2中和抗体,并且可保护小鼠免受DENV-2 NGC强毒株的脑内攻击;rDENV4/2和Ban18HK20均对猴体无脑内神经毒力。【结论】成功构建了稳定的Ban18HK20感染性克隆,建立了用于DENV研究的反向遗传学技术平台。确定E155位氨基酸是登革病毒4型Ban18HK20株毒力关键位点。嵌合病毒rDENV4/2对小鼠及猴体均无神经毒力,且能保护小鼠免受DENV-2 NGC病毒的脑内攻击。本研究为登革病毒的致病机理和登革热疫苗的研究奠定了基础,具有十分重要的理论价值和实际意义。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 房恩岳
导师: 李玉华
关键词: 登革病毒,登革热疫苗,反向遗传学,感染性克隆,登革嵌合疫苗,神经毒力
来源: 中国食品药品检定研究院
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 中国食品药品检定研究院
分类号: R373.33
总页数: 90
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