导读:本文包含了异源表达系统论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:酵母,载体,基因,体循环,糖苷酶,蛋白,肽酶。
异源表达系统论文文献综述
林鑫,刘磊,孔令聪,裴志花,刘树明[1]（2019）在《细菌异源表达系统优化策略研究进展》一文中研究指出目前,采用细菌表达系统异源表达抗菌肽已成为研究热点,虽然异源表达为提高抗菌肽产量提供了有效的途径,但近年来发现细菌异源表达抗菌肽的产量仍受表达载体及宿主菌等多方面的制约。为此,拟对优化密码子、添加启动子、串联多聚体、融合标签及杂合抗菌肽等异源表达系统优化策略的相关研究进展进行综述,以期为提高抗菌肽表达产量提供理论依据。(本文来源于《动物医学进展》期刊2019年10期）
王亚南[2]（2019）在《β-葡萄糖苷酶的异源表达以及CRISPR-Cas9系统在草酸青霉中的应用》一文中研究指出随着石化燃料消耗速率的不断增加,环境和资源危机日益加剧。因此,迫切需求生物乙醇、生物柴油和生物氢等替代型能源。植物来源的生物质是地球上最为丰富的可再生资源。利用植物生物质原料向生物燃料和化学品的高效转化可以有效地缓解能源和环境危机。丝状真菌可高效地表达木质纤维素酶,降解植物生物质,对自然界的碳循环发挥着重要的作用。目前,在丝状真菌中,木质纤维素酶系的低水解效率导致的酶使用高成本是木质纤维素生物质经济转化中的主要瓶颈。丝状真菌木质纤维素降解酶系由多种水解酶组成,主要包括外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中重要的组分之一,其主要作用是将纤维寡糖或纤维二糖水解为葡萄糖,对纤维素的降解有重要作用,但其含量占整个酶系的比重相对较低,成为限制纤维素酶高效转化生物质资源的重要因素。因此,以木质纤维素酶高产菌株草酸青霉(Penicillium oxalicum)为靶点,重构纤维素酶系的表达调控,构建产β-葡萄糖苷酶高性能菌株,对增强纤维素酶在生物质资源的高效转化应用方面具有重要意义。本论文主要研究成果如下:1.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在草酸青霉中的异源表达前期研究中,构建了一株纤维素酶高产菌株草酸青霉PT3-1,其纤维素酶表达水平相比出发菌株有大幅度提高,但β-葡萄糖苷酶的表达量相对较低。因此,设想在草酸青霉中异源表达其它丝状真菌来源的β-葡萄糖苷酶的方式来解决这一问题。已有研究结果发现,来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶具有较高的比活力,且葡萄糖耐受性较高,这将利于提高对纤维素的降解效率。本实验中,我们构建了叁种β-葡萄糖苷酶(来源于黑曲霉)的过表达盒,分别以草酸青霉的bgl2启动子、cbh1启动子和PDE_02864基因启动子作为黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因异源表达盒的启动子。将以上叁种表达盒在高产纤维素酶菌株PT3-1中进行表达,得到了一株高产β-葡萄糖苷酶菌株C3-1。C3-1突变株在发酵120 h后β-葡萄糖苷酶活力达到172.6 U/mL,分别比野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1提高了244倍和156倍;滤纸酶活为3.2 U/mL,分别比野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1提高了7倍和1.5倍。得到一株高滤纸酶活菌株CD46-1,在发酵144 h的滤纸酶活最高为3.43 U/mL,分别是野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1的7.5倍和1.6倍,其胞外蛋白也明显增多。2.优化β-rec/six重组系统构建高产β-葡萄糖苷酶菌株在前期研究结果中,已经在草酸青霉中建立了β-rec/six位点的遗传筛选标记循环利用系统。但利用该系统去除筛选标记后,β-丝氨酸重组酶基因仍留存在染色体上,这可能会对染色体上其他位点产生不利影响。通过查阅文献,对β-rec/six重组系统进行了优化,构建了在转化子基因组中无Rec重组酶痕迹的重组系统。在利用该系统去除筛选标记的同时,β-丝氨酸重组酶基因也被切除,避免了因β-丝氨酸重组酶基因的持续表达产生的不利影响。该系统可用于后续β-葡萄糖苷酶高产菌株的构建。3.CRISPR-Cas9系统在草酸青霉中的应用CRISPR-Cas9系统是一种强大的基因编辑方法,目前已广泛应用于丝状真菌中。然而,在草酸青霉中尚未报道关于该基因编辑系统的应用。本章研究中,在草酸青霉中尝试表达携带Cas9蛋白基因的质粒,并筛选了多种用于体内转录sgRNA的RNA聚合酶III型(Pol III)的启动子,构建了多种不同的sgRNA表达盒,初步探究了CRISPR-Cas9基因编辑系统草酸青霉中的应用。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2019-05-28）
孙宁宁[3]（2018）在《里氏木霉异源表达纤维二糖水解酶Te-Cel7A与系统分析蛋白酶Spt1功能》一文中研究指出里氏木霉(Trichoderma reesei)是目前生产纤维素酶的主要工业菌株,其分泌的纤维素酶系能够将木质纤维素水解为葡萄糖以供生物乙醇的生产。然而,在工业降解木质纤维素的过程通常需要纤维素酶具有耐热和高稳定性等特性。因此,在里氏木霉中表达热稳定纤维素酶是改良纤维素酶系的策略之一。此外,里氏木霉中的蛋白酶可能会对蛋白分泌表达产生影响,但目前对其认识仍不清晰。本论文一方面在里氏木霉中异源表达热稳定纤维素酶对里氏木霉酶系进行改良,另一方面研究里氏木霉液泡蛋白酶功能,然后利用液泡蛋白酶靶点深入改造热稳定纤维素酶异源表达的工程菌株,从而构建起纤维素酶系优化的里氏木霉工程菌。主要研究内容如下:(一)在里氏木霉中异源表达热稳定纤维二糖水解酶Te-Cel7A利用组成型强启动子Pcdna1和内源cbh1信号肽SP成功构建了Te-Cel7A的表达盒。表达盒转化里氏木霉QP4原生质体后筛选得到了一株纤维素水解能力强的转化子,命名为QTC14。在葡萄糖条件下QTC14能够分泌有活力的且酶成分单一的Te-Cel7A蛋白。对其酶学性质进行分析发现,Te-Cel7A的最适酶活温度为65℃,最适p H为5.0,与T.emersonii所分泌的天然Te-Cel7A的性质相似,说明在里氏木霉中可以异源表达热稳定纤维素酶。在产酶发酵条件下,里氏木霉QTC14的CBH酶活相较出发菌株QP4提高了28.8%,FPA酶活提高了65.2%。另外,QTC14总纤维素酶和CBH的热稳定性也高于出发菌株QP4。当QTC14的发酵酶液用于糖化不同木质纤维素底物时,QTC14对脱木素木糖渣和未脱木素木糖渣的糖化效率均高于出发菌株QP4。特别是糖化脱木素木糖渣时,QTC14的糖转化率为49.3%,与QP4的糖转化率相比提高了13.9%。这说明里氏木霉可以成功实现异源热稳定纤维素酶的表达,产生的重组纤维素酶系在生物质转化方面具有潜在的应用价值。(二)里氏木霉液泡丝氨酸蛋白酶Spt1的功能研究里氏木霉蛋白酶Spt1的蛋白序列分析发现,该蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶家族中的类枯草杆菌蛋白酶,具有前导肽,可能属于液泡蛋白。为探究里氏木霉Spt1的功能,我们分别构建了Spt1缺失菌株Δspt1及回补菌株Rspt1。结果显示,Spt1的缺失使得里氏木霉孢子产量显着降低,Spt1回补之后生孢性状恢复,说明Spt1参与了里氏木霉孢子的形成。同时,Δspt1在不同碳源上的生长速率不受影响,但是影响菌株对纤维素的降解能力。通过分析Δspt1和Rspt1的胞外纤维素酶活力发现,Δspt1的胞外蛋白分泌量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活均显着下降,而Spt1回补之后,纤维素酶活力得到恢复。上述结果说明,Spt1与里氏木霉纤维素酶的合成与分泌有关。为了确认Spt1是否位于液泡,进一步利用绿色荧光蛋白对Spt1进行细胞定位研究,结果表明里氏木霉丝氨酸蛋白酶Spt1位于液泡中。为了研究Spt1对纤维素酶系的改良作用,我们利用spt1自身启动子和组成型强启动子cdna1分别构建了Spt1过表达菌株SOE和SOD。通过分析SOE和SOD的纤维素酶活力进行发现,Spt1的过表达能够显着提高里氏木霉的纤维素酶的酶活。尤其利用组成型强启动子cdna1构建的Spt1过表达菌株SOD,与出发菌株QP4相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别提高了65.9%、140%、48.8%、265%和260%。说明Spt1是改造里氏木霉酶系的有效靶点。(叁)在里氏木霉QTC14中过表达Spt1为构建纤维素酶系更加优良的里氏木霉工程菌,我们将Spt1在异源表达热稳定性Te-CBH1的里氏木霉工程菌QTC14中进行了过表达研究,成功构建了里氏木霉工程菌STC。通过分析STC和QTC14的纤维素酶活力发现,STC与QTC14相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别增长了10%、10%、22%、15%、34%。这些结果表明,以液泡蛋白酶Spt1为靶点,可以实现对里氏木霉工程菌株的进一步改良,提升纤维素酶分泌水平及纤维素酶系活力,从而有助于降低纤维素酶生产成本并促进生物乙醇工业发展。(本文来源于《山东师范大学》期刊2018-05-30）
郭志行[4]（2017）在《Ⅲ型分泌系统抑制剂的筛选、机制及相关蛋白的异源表达与结晶》一文中研究指出致病菌对人类社会生活造成的困扰不容忽视,在对抗致病菌的过程中,抗菌药物发挥了重大的作用,但同时也带来了困扰。在医院及各个社区抗菌药物的滥用现象很普遍,由此导致的耐药菌株对人类公共卫生安全造成了很大的威胁。细菌受到的强烈生存压力是耐药菌株产生的主要原因,故寻求既可以降低致病性又对病原体生长不影响的新型抗菌药物迫在眉睫。Ⅲ型分泌系统(T3SS)是存在于革兰氏阴性致病菌中高度保守的毒力因子,是一种注射器状的毒性蛋白运输系统,分泌效应蛋白到宿主细胞促进侵袭。本论文选用具有感染致病性的鼠伤寒沙门氏菌菌株,进行T3SS的具体探讨。首先对提取分离的20个异戊烯基取代化合物采用SDS-PAGE进行初步的筛选,并对有抑制作用的化合物进行复筛确认及Western Blotting验证,并对其构效关系进行简单的探讨,未发现显着的共同结构特征。其中,作用最强的是Licoflavonol(LCF),对毒性蛋白SipA、SipB、SipC和SipD均有明显的抑制作用,且对鞭毛蛋白FliC几乎没有影响。同时,LCF对T3SS毒性蛋白的抑制呈现明显的浓度梯度依赖,且对沙门氏菌的正常生长几乎没有影响。故选取LCF进行作用机制的深入探讨。随后对LCF作用机制研究,沙门氏菌侵袭HeLa细胞的同时加药检测SipC含量,发现LCF抑制SipC的转运;通过RT-PCR检验LCF对T3SS相关基因的转录影响,发现LCF通过抑制SicA/InvF基因的转录而抑制SipC毒性蛋白的分泌。另外检测LCF对针尖蛋白的影响,发现LCF对针尖复合物NC中PrgH的组装影响不大。同时,对课题组前期筛选得到的活性较好的抑制剂Csn-B进行合成,以寻找Csn-B与相关蛋白的结合位点。本论文的合成途径为将原料3,5-二甲氧基苯乙酸进行酰化反应,然后脱甲基反应,最后酯化形成目标产物Csn-B。最后,本论文针对鼠伤寒沙门氏菌T3SS中分子伴侣SicA及转录因子InvF基因进行克隆、异源表达与蛋白质的结晶及与小分子化合物的共晶。经过不断的尝试及不同constructs的构建,SicA蛋白得到柱状棱型晶体;而InvF蛋白从最初的包涵体终于可溶。综上,本论文主要进行T3SS抑制剂的筛选,发现新型天然化合物LCF,并对其作用机制进行探索,对于开发新型抗耐药型抗生素具有积极的意义。(本文来源于《山东大学》期刊2017-04-08）
夏军[5]（2016）在《运用CRISPR/Cas系统在大肠杆菌中异源表达希瓦氏菌脂肪酸代谢相关基因及其对脂肪酸代谢的影响》一文中研究指出大肠杆菌是一个遗传背景清楚,遗传操作手段已经很成熟的模式菌株,而且到目前为止工程化大肠杆菌已经进行了很深入的研究。而这其中工程改造脂肪酸途径极大的吸引着研究者们的眼球,因为脂肪酸作为细胞膜的组成部分,对生物体具有重要的生理意义,同时也与我们日常生活息息相关。因此在大肠杆菌体内构建脂肪酸生产的工程菌株具有重要的意义和应用价值。CRISPR/Cas是目前基因编辑的一个重要以及新兴技术,利用该技术国内外研究人员已经开始在多个物种,多种方面应用该技术。本论文旨在以大肠杆菌作为研究对象,构建CRISPR/Cas这个基因编辑系统,对大肠杆菌与脂肪酸代谢相关基因进行改造,并引入富油脂海洋细菌(冷海希瓦氏菌)中与脂肪酸代谢相关基因在大肠杆菌中进行表达,初步探索该系统在大肠杆菌中的应用,通过改造脂肪酸代谢途径来提高脂肪酸含量。据此本实验得出如下实验结论:(1)利用http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html设计出了用于基因编辑的spacer,然后利用重迭PCR将该序列构建进能在大肠杆菌中高效表达的CRISPR/Cas系统的载体中,获得了在大肠杆菌中发挥作用的CRISPR/Cas系统载体。紧接着利用重迭PCR成功克隆出对应的donor,最后利用电转的方法将donor与CRISPR/Cas系统载体成功的导入宿主大肠杆菌中。(2)成功构建了ΔPEPC分,ΔPEPC,ΔPEPC分-ΔFad D,ΔPEPC-ΔFad D以及ΔFad D突变体菌株,同时也成功克隆到了冷海希瓦氏菌的fad R,delta-9 desaturase和acc基因,并将这些基因分别或者串联敲入到大肠杆菌基因组中,成功获得了ΔPEPC::F/D,ΔPEPC::ACC以及ΔFad D::F/D和ΔFad D:ACC突变体菌株。(3)针对于ΔPEPC分,ΔPEPC,ΔPEPC分-ΔFad D,ΔPEPC-ΔFad D以及ΔFad D突变体菌株,采用气相色谱-质谱(GC-MS)对脂肪酸进行定性及定量分析其脂肪酸含量均比野生型要高,最高的增长了3.7%,但是敲出pepc基因获得的总脂肪酸增长量并没有预期的高,同时针对ΔDPEPC::F/D,ΔDPEPC::ACC以及ΔFad D::F/D和ΔFad D:ACC突变体菌株,与野生型相比,最高的菌株脂肪酸含量达到了13.1%,几乎比野生型增长了5.3%。但是在脂肪酸组成山与野生型相比没有任何变化,都含有1:0,12:0,13:0,14:0,15:0,16:0,17:1,17:0,18:0,并且16:0,17:0,18:0占主要组成部分,这与预期的可以获得不饱和脂肪酸的理论有些偏差。(本文来源于《石河子大学》期刊2016-06-01）
祁浩[6]（2016）在《人胰高血糖素样肽-1酵母系统异源表达》一文中研究指出本文以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为模式生物通过基因工程方法对核糖体蛋白质合成起始阶段进行人工调控,研究宿主靶基因上调表达介导的核糖体循环加速对异源蛋白表达效率的影响。因此,研究最终目标就是加速核糖体蛋白合成起始速率提升真核细胞异源蛋白表达效率。e IF4B在蛋白合成起始阶段对mRNA的招募起到关键作用,是蛋白翻译的起始因子,通过其编码基因Tif3的过表达验证其对人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和红色荧光蛋白(RFP)组成的融合蛋白GLP-1-RFP表达效率的影响来验证其提高外源蛋白表达效率的可行性。首先合成含有报告基因Rfp的GLP-1融合蛋白基因Glp-1-rfp;启动子CUP1和终止子CYC1融合基因Qfh;用限制性内切酶EcoRI和Hind ⅡI双酶切质粒YEplac112和pMV-QFH,T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建质粒YEplac112-P_(CUP1)-T_(CYC1),用限制性内切酶PstI和BamHI双酶切质粒YEplac112-P_(CUP1)-T_(CYC1)和基因Glp-1-rfp,T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建酿酒酵母表达载体YEplac112-P_(CUP1)-GLP-1-RFP-T_(CYC1)。转化酿酒酵母W303菌株后,用铜离子诱导基因Glp-1-rfp的表达。在绿色激发光下观察酿酒酵母细胞发出明显的红色荧光,证明基因Glp-1-rfp在酿酒酵母W303中成功表达。克隆基因Tif3;启动子GAL基因,Gal;终止子CYC1基因,Cyc1;用限制性内切酶HindⅡI和XbaI分别双酶切质粒YCplac33和基因Gal,回收酶切产物后用T4连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞筛选阳性克隆子,构建质粒YCplac33-P_(GAL);用限制性内切酶PstI和BamHI分别双酶切基因Tif3和质粒YCplac33-P_(GAL),回收酶切产物后用T4连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞筛选阳性克隆子,成功构建质粒YCplac33-P_(GAL)-TIF3;用限制性内切酶SmaI和EcoRI分别双酶切基因Cyc1和质粒YCplac33-P_(GAL)-TIF3,回收酶切产物后用T4连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞筛选阳性克隆子,成功构建酿酒酵母W303表达载体YCplac33-P_(GAL)-TIF3-T_(CYC1);酿酒酵母表达载体YCplac33-P_(GAL)-TIF3-T_(CYC1)和YEplac112-P_(CUP1)-GLP-1-RFP-T_(CYC1)转化酿酒酵母W303菌株后,用半乳糖和铜离子分别诱导基因Glp-1-rfp和基因Tif3的表达。在诱导时间相同的情况下,在绿色激发光下观察重组酿酒酵母细胞,只转化了基因Rfp的酿酒酵母经诱导表达后细胞发出了明显的红色荧光,证明基因Glp-1-rfp在酿酒酵母W303中成功表达;同时转化了基因Glp-1-rfp和基因Tif3的酿酒酵母经诱导表达后细胞发出了荧光强度更高的红色荧光,证明了基因Tif3和基因Glp-1-rfp同时在酿酒酵母W303中得到表达,且基因Tif3编码的e IF4B上调表达后提高了基因Glp-1-rfp表达外源蛋白的效率。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2016-05-29）
李广京,杨静美,叶滔,胡安龙[7]（2014）在《抗菌肽基因异源表达系统研究进展》一文中研究指出抗菌肽是机体天然免疫系统的重要组成部分,因具有抗菌谱广、活性稳定、不易产生耐药性等优点而在食品、饲料、农业、医药领域具有重要的应用价值。由于化学合成的成本较高,利用基因工程技术构建高效的生物表达系统成为一个新的途径。综述了抗菌肽在细菌、酵母、植物、动物等表达系统中异源表达的研究进展,为抗菌肽的研究应用提供理论依据。(本文来源于《广东农业科学》期刊2014年17期）
汪海洋[8]（2014）在《人源羧肽酶B异源表达及构建丝氨酸蛋白酶基因缺陷型粟酒裂殖酵母表达系统》一文中研究指出本文主要研究了人源羧肽酶B在大肠杆菌以及粟酒裂殖酵母中的表达。同时,还研究了粟酒裂殖酵母丝氨酸蛋白酶缺陷型表达系统构建的情况。羧肽酶B(carboxypeptidase B,CPB)是一类水解蛋白或多肽底物C-端Lys或Arg的金属蛋白酶。当前,羧肽酶B已广泛应用于蛋白质、多肽的末端修饰,急性胰腺炎及胰腺植皮排斥的血清标记,尤其在胰岛素原活化为胰岛素的过程中,羧肽酶B是不可缺少的双酶(胰蛋白酶及羧肽酶B)之一。本实验通过克隆人源羧肽酶B基因分别在原核表达系统和真核表达系统中表达。构建了重组质粒pHsh-CPB1,pHsh-B5K-CPB1,pHsh-DT-CPB1。在大肠杆菌DH10B和BL21(DE3)中,使用一种新型热激载体pHsh,但由于异源羧肽酶B对大肠杆菌宿主系统的蛋白毒性较强,产物表达积累后会导致宿主死亡。即使在有信号肽的情况下,依然无法纯化出目的蛋白酶。构建了重组分泌表达质粒peno-GFA-cpy-CPB1。在真核表达系统S. pombe gfa基因营养缺陷型菌株中,重组羧肽酶B表达,但产量较低。对重组菌细胞破碎样品和胞外培养基超滤离心并替换相应的缓冲液后的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果能够显示有重组蛋白特异性条带。而用粗酶进行的酶活检测时重组蛋白酶的酶活较低。本实验还研究了构建敏感型蛋白酶缺陷型粟酒裂殖酵母表达系统。通过敲除在异源蛋白表达过程中粟酒裂殖酵母本身丝氨酸型蛋白酶基因以阻碍其对重组蛋白的水解降解作用。选择了粟酒裂殖酵母细胞中对羧肽酶B分泌表达可能产生影响的丝氨酸蛋白酶基因进行敲除。构建了基因缺陷型粟酒裂殖酵母表达系统yHL6381Agfa-△isp6。蛋白酶基因缺陷型粟酒裂殖酵母宿主构建的主要目的是探索可以阻碍异源蛋白表达过程中宿主本身敏感型蛋白酶对异源蛋白的抑制或降解作用。但本实验挑选的敲除基因并没有取得提高表达的预期效果。原因可能是由于粟酒裂殖酵母菌中这类潜在的敏感型蛋白酶不止一种,且同一种类型的蛋白酶可能分布在不同的染色体上,不能仅凭一种或几种表达相关途径的基因作为最终的功能筛查。另外,本实验在对人源羧肽酶B表达可能相关的基因敲除中发现,同时敲除基因组内多个基因对宿主细胞的正常生长将产生严重的影响,无法筛选出多个基因缺陷的菌株。(本文来源于《南京师范大学》期刊2014-04-25）
李宁娟[9]（2009）在《玉米谷氨酰胺转胺酶异源表达系统构建及酶学性质的研究》一文中研究指出谷氨酰胺转胺酶(Transgfutaminase,TGase)是一类催化酰基发生转移的蛋白酶,主要催化蛋白质或多肽分子中谷酰胺残基的γ-酰胺基发生转移反应,当酰基受体为赖氨酸的ε-氨基时,TGase催化蛋白分子之间或之内形成ε-(γ-谷胺酰)赖氨酸键,使得蛋白发生交联,从而改变其结构和理化性质,甚至带来新的功能,因此,TGase在工农业、食品、化妆品和医药领域中有着极为广泛的应用。本实验根据GeneBank公布的玉米TGase基因的cDNA序列,利用分子生物学手段将玉米谷氨酰胺转胺酶(TGase)基因克隆到两种不同的异源表达系统中进行异源表达,并对玉米TGase的酶学性质进行了初步研究。首先采用Trizol法从玉米幼苗叶片中提取玉米叶片的总RNA,RT-PCR扩增得到了玉米TGase,将其克隆到PMD-18T载体上,经过PCR、酶切和测序鉴定,克隆得到的玉米TGase基因与GeneBank上公布的TGZ15(AJ421525)的同源性为100%,完全一致。利用生物信息学软件对玉米TGase进行了序列分析,通过ChloroP 1.1、DNAStar和Oimga 2.0对该序列编码的蛋白的亲疏水性、二级结构和Motif进行了预测。TGase氨基酸序列的1-47个氨基酸编码一个叶绿体转运肽,TGase整个分子为亲水性分子,空间结构中散布着较多的α螺旋和少量的β折叠,属于典型的α+β类型结构。在成功克隆得到玉米谷氨酰胺转胺酶基因的基础上将其构建到原核表达载体pLLP-OmpA上,并转化大肠杆菌Top10F’。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析没有检测到目的蛋白带的表达,在发酵液中也没有检测到TGase活性,说明对于玉米TGase原核表达的方案并不是很成功。为了找到更加合适的玉米谷氨酰胺转胺酶异源表达系统,本研究将玉米TGase基因克隆到了真核表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母GS115,筛选得到高拷贝的转化子。转化子经甲醇诱导96h时,表达上清酶活为0.3U/ml, SDS-PAGE分析在61kDa处检测到了目的蛋白的表达,对酪蛋白的交联反应进一步确定了玉米谷氨酰胺转胺酶基因在毕赤酵母中进行了有效表达。接着本实验从暗光培养的玉米幼苗中提取了天然的玉米TGase,并对初步测定了其酶学性质,经过40%-70%的硫酸铵沉淀,玉米TGase被提纯了2.01倍回收率为34.6%,通过天然TGase对酪蛋白的交联初步确定了其最适作用pH值为8.5,最适反应温度为45℃。本研究在成功克隆得到玉米TGase基因的基础上,利用生物信息学软件进行了序列分析,之后将克隆的基因克隆到了大肠杆菌和毕赤酵母两个异源表达系统中,经诱导、活性测定和SDS-PAGE分析证明该基因在毕赤酵母中进行了有效表达。本实验为进一步利用基因工程方法获得食品用的谷氨酰胺转胺酶奠定了理论和实践基础,也为利用基因工程技术生产植物源性酶制剂进行了有益的探索。(本文来源于《哈尔滨工业大学》期刊2009-06-01）
郭强[10]（2008）在《水稻OsPT2和OsPT6在异源表达系统中的功能鉴定》一文中研究指出磷是植物生长发育必需的大量元素之一。它是植物细胞结构物质的组成成分,存在于磷脂、核酸和核蛋白中,在遗传信息的传递和细胞结构的维持中起到重要作用。土壤中有效磷浓度通常在10μM以下,而植物细胞的有效磷浓度则在100-2000μM范围。因此,土壤有效磷的供应状况和植物对磷素营养的吸收能力便成为限制植物生长发育的决定因素之一,研究植物吸收、利用磷素的分子生物学基础对提高植物的磷效率具有重要意义。高等植物对磷素的吸收有两大系统:低亲和系统(Low-Affinity System)和高亲和系统(High-Affinity System)。迄今为止,在植物中克隆的磷转运蛋白基因基本上归属于Pht1和Pht2两大家族。根据对磷转运蛋白基因序列相似性和转录分析,推断水稻中含有13个Pht1家族成员,用于从土壤溶液中(包括水稻的菌根菌丝体)吸收磷以及植物体内磷的运输,其中磷转运蛋白基因OsPT2和OsPT6是Pht1家族中两个在缺磷和低磷诱导下强烈表达的基因。本研究选取OsPT2和OsPT6进行定位鉴定和功能分析。1、采用半定量RT-PCR法检测水稻Pht1家族的各个成员在缺磷与供磷处理21天后组织特异性和时空表达特征,结果表明:OsPT3、OsPT8等为组成型表达,不受磷水平的诱导和限制,而OsPT1、OsPT2、OsPT6、OsPT7等是在根部受低磷水平诱导表达,其中OsPT2和OsPT6诱导表达最为强烈。2、对野生型(WT)、突变体MB192以及含有OsPT6的酵母转化子生长曲线和吸收磷素能力的比较,发现OsPT6表达后可以增强突变体对磷的吸收,但是作用略低于WT。采用同位素标记的方法对OsPT6吸收磷的速率作进一步分析表明,磷转运蛋白OsPT6吸收磷素的Km值为96μM,属于高亲和磷转运蛋白。3、通过转化OsPT6的酵母对不同pH环境响应结果表明:OsPT6是一个依赖于酵母细胞膜内外质子梯度的磷转运蛋白,其吸收磷素的最佳pH为6.0;OsPT6是通过Pi/H~+的共转运实现对磷素的吸收并依赖于细胞膜上的H~+-ATPase产生质子梯度及提供能量。4、通过融合蛋白表达技术将OsPT2和OsPT6两个基因在哺乳动物HEK293细胞中的表达分析表明,该基因能够编码蛋白质并于细胞膜上表达,与其功能特点相一致。综上所述,OsPT6在酵母系统的表达说明该基因是一个与质子共运输的的高亲和磷转运蛋白,OsPT2不能在酵母中检测到表达。而水稻OsPT2和OsPT6都可以在HEK293细胞中表达,是定位在细胞膜上的运输蛋白。(本文来源于《南京农业大学》期刊2008-06-01）
异源表达系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
随着石化燃料消耗速率的不断增加,环境和资源危机日益加剧。因此,迫切需求生物乙醇、生物柴油和生物氢等替代型能源。植物来源的生物质是地球上最为丰富的可再生资源。利用植物生物质原料向生物燃料和化学品的高效转化可以有效地缓解能源和环境危机。丝状真菌可高效地表达木质纤维素酶,降解植物生物质,对自然界的碳循环发挥着重要的作用。目前,在丝状真菌中,木质纤维素酶系的低水解效率导致的酶使用高成本是木质纤维素生物质经济转化中的主要瓶颈。丝状真菌木质纤维素降解酶系由多种水解酶组成,主要包括外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中重要的组分之一,其主要作用是将纤维寡糖或纤维二糖水解为葡萄糖,对纤维素的降解有重要作用,但其含量占整个酶系的比重相对较低,成为限制纤维素酶高效转化生物质资源的重要因素。因此,以木质纤维素酶高产菌株草酸青霉(Penicillium oxalicum)为靶点,重构纤维素酶系的表达调控,构建产β-葡萄糖苷酶高性能菌株,对增强纤维素酶在生物质资源的高效转化应用方面具有重要意义。本论文主要研究成果如下:1.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在草酸青霉中的异源表达前期研究中,构建了一株纤维素酶高产菌株草酸青霉PT3-1,其纤维素酶表达水平相比出发菌株有大幅度提高,但β-葡萄糖苷酶的表达量相对较低。因此,设想在草酸青霉中异源表达其它丝状真菌来源的β-葡萄糖苷酶的方式来解决这一问题。已有研究结果发现,来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶具有较高的比活力,且葡萄糖耐受性较高,这将利于提高对纤维素的降解效率。本实验中,我们构建了叁种β-葡萄糖苷酶(来源于黑曲霉)的过表达盒,分别以草酸青霉的bgl2启动子、cbh1启动子和PDE_02864基因启动子作为黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因异源表达盒的启动子。将以上叁种表达盒在高产纤维素酶菌株PT3-1中进行表达,得到了一株高产β-葡萄糖苷酶菌株C3-1。C3-1突变株在发酵120 h后β-葡萄糖苷酶活力达到172.6 U/mL,分别比野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1提高了244倍和156倍;滤纸酶活为3.2 U/mL,分别比野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1提高了7倍和1.5倍。得到一株高滤纸酶活菌株CD46-1,在发酵144 h的滤纸酶活最高为3.43 U/mL,分别是野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1的7.5倍和1.6倍,其胞外蛋白也明显增多。2.优化β-rec/six重组系统构建高产β-葡萄糖苷酶菌株在前期研究结果中,已经在草酸青霉中建立了β-rec/six位点的遗传筛选标记循环利用系统。但利用该系统去除筛选标记后,β-丝氨酸重组酶基因仍留存在染色体上,这可能会对染色体上其他位点产生不利影响。通过查阅文献,对β-rec/six重组系统进行了优化,构建了在转化子基因组中无Rec重组酶痕迹的重组系统。在利用该系统去除筛选标记的同时,β-丝氨酸重组酶基因也被切除,避免了因β-丝氨酸重组酶基因的持续表达产生的不利影响。该系统可用于后续β-葡萄糖苷酶高产菌株的构建。3.CRISPR-Cas9系统在草酸青霉中的应用CRISPR-Cas9系统是一种强大的基因编辑方法,目前已广泛应用于丝状真菌中。然而,在草酸青霉中尚未报道关于该基因编辑系统的应用。本章研究中,在草酸青霉中尝试表达携带Cas9蛋白基因的质粒,并筛选了多种用于体内转录sgRNA的RNA聚合酶III型(Pol III)的启动子,构建了多种不同的sgRNA表达盒,初步探究了CRISPR-Cas9基因编辑系统草酸青霉中的应用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
异源表达系统论文参考文献
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论文知识图
