利用CRISPR-Cas9技术构建S100A8基因敲除的CNE2细胞系

论文摘要

目的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建S100A8基因敲除的CNE2稳定细胞系。方法通过慢病毒转染,构建可以稳定表达Cas9蛋白的CNE2细胞株。针对S100A8基因作用的功能区域,设计靶向S100A8基因的g RNA,构建Lentiguide-Puro-sg重组质粒并转化stbl3感受态细胞,筛选出重组子后通过测序验证g RNA的有效性。测序鉴定后将Lentiguide-Puro-sg重组载体通过转染试剂转染CNE2细胞系。通过嘌呤霉素进行阳性单克隆筛选,通过Western Blot检测S100A8基因的表达。结果测序结果显示LentiGuide-Puro-sg载体构建成功;Western Blot结果显示转染过LentiGuide-Puro-sg重组载体的细胞的S100A8不表达。结论利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了S100A8基因敲除的CNE2细胞,为后续继续研究S100A8基因在鼻咽癌细胞中的作用机制和功能奠定了基础。

论文目录

• 0 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 细胞株、慢病毒、质粒及菌株
•   1.2 试剂
•   1.3 基因测序与引物序列合成
•   1.4 实验方法
•     1.4.1 绘制细胞生长抑制曲线
•     1.4.2 慢病毒转染
•     1.4.3 qRT-PCR检测Cas9蛋白表达情况
•     1.4.4 Western Blot验证Cas9蛋白表达情况
•     1.4.5 gRNA的设计与合成
•     1.4.6 载体构建
•     1.4.7 CNE2细胞培养及转染
•     1.4.8 敲除S100A8基因的CNE2细胞单克隆筛选及鉴定
• 2 结果
•   2.1 抑制率曲线绘制
•   2.2 慢病毒转染结果验证
•   2.3 Western blot检测转染后CNE2细胞的Cas9蛋白表达情况
•   2.4 Lentiguide-Puro-S100A8-sg载体构建后的验证
•   2.5 S100A8基因敲除验证
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 孟盈,杨建宇,欧阳春,黄元姣

关键词: 技术,鼻咽癌,基因敲除

来源: 智慧健康 2019年10期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,肿瘤学,眼科与耳鼻咽喉科

单位: 广西医科大学

基金: 国家自然科学基金资助项目(81260405),广西自然科学基金项目(2015GXNSFAA139215)

分类号: Q78;R739.63

DOI: 10.19335/j.cnki.2096-1219.2019.10.009

页码: 17-20

总页数: 4

文件大小: 2005K

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