桔青霉来源的核酸酶P1在黑曲霉系统中的重组表达研究

论文摘要

来源于桔青霉的核酸酶P1隶属于核酸酶S1/P1家族,其家族成员中的核酸酶P1和核酸酶S1均是单链特异性核酸酶,能够催化单链DNA或RNA生成核苷酸,生成的5’-核苷酸及其衍生物广泛应用于制药、食品和核酸结构的研究中。在生物制药方面,其可用于制造各种生化药物。在食品保健方面,在酵母自溶过程中添加核酸酶P1促进RNA转变为5’-GMP及5’-AMP的速率,这两种物质是制作各种食品调味剂的原料。在核酸研究方面,核酸酶P1的主要功能有促进核酸结构的研究和碱基组成的分析。目前国内核酸酶P1供不应求,核酸酶P1的生产菌主要为桔青霉,而桔青霉生产的核酸酶P1具有纯度不高,杂蛋白过多且有毒素掺杂影响后续的分离纯化等问题。核酸酶P1异源表达的宿主有大肠杆菌和酵母细胞,表达的核酸酶P1活力较低。而本研究在黑曲霉中实现了核酸酶P1的高效重组表达,并将其应用于核苷酸的生产中。本文以一株低蛋白背景的无孢黑曲霉Bdel4（LB3ang02D4,在黑曲霉SH-2菌株基础上敲除了糖化酶glaA、淀粉酶aamA、An05g02100和An12g06930）为宿主菌,构建了不同表达策略的核酸酶P1的黑曲霉表达质粒,转化黑曲霉筛选出了一株核酸酶P1表达最优的转化子,发酵酶液经His亲和层析纯化后,进行了核酸酶P1酶学性质的研究,并探索了其在核苷酸的生产中的应用。主要研究的内容如下:（1）根据Uniprot公布的NP1的蛋白序列,经过密码子优化后人工合成Nuc P1基因。将6xHis标签加在Nuc P1基因的C末端,以用于后续的His亲和层析获得核酸酶P1的纯酶液。构建采用Kexlinker（糖化酶自带的信号肽切割位点）、2A肽、融合蛋白等不同表达策略的核酸酶P1的表达框,基于同源重组原理定点整合核酸酶P1的表达框到黑曲霉基因组糖化酶glaA基因位置、18S rDNA和28S rDNA的多拷贝位置,通过测定转化株的酶活水平筛选出酶活最高的一株黑曲霉转化株Bpnu-18S-2,其发酵至144 h时酶活达到89.2 U/mL。（2）通过His亲和层析纯化重组核酸酶P1菌株产生的发酵液,纯化后核酸酶P1的分子量大小为38kDa,之后用糖苷酶PNGase F去糖基化后得到核酸酶P1大小为30 kDa,与PDB数据库预测的核酸酶P1分子量一致。基于纯化所得的核酸酶P1研究其酶学性质,测定得到重组核酸酶P1反应最适pH为5.3,最适温度为65°C,加入2 mmol/L的Cu2+、Mg2+、Zn2+能够提高核酸酶P1的酶活,同时也显著提高了核酸酶P1的耐热性,Ni+约降低20%酶活力,但却能提高核酸酶P1的耐热性,K+、EDTA使核酸酶P1的酶活力约降低40%。将黑曲霉转化株Bpnu-18S-2的发酵上清液加入酵母自溶体系中以提高核苷酸的产量,添加75 U的核酸酶P1可生产出14.13 mg/mL的核苷酸,比不添加核酸酶P1时产生的单位核苷酸的产量提高了4.51 mg/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 核酸
•     1.1.1 核酸的分类
•     1.1.2 核酸的水解产物—核苷酸
•   1.2 核酸酶
•     1.2.1 核酸酶的分类
•     1.2.2 核酸酶P1的结构
•     1.2.3 核酸酶P1的性质
•     1.2.4 核酸酶P1的催化机理
•     1.2.5 核酸酶P1的功能
•   1.3 核酸酶P1的研究进展
•     1.3.1 核酸酶P1的生产情况
•     1.3.2 核酸酶P1生产5’-核苷酸
•   1.4 论文研究的主要内容
•     1.4.1 研究内容
•     1.4.2 研究意义
• 第二章 核酸酶P1在黑曲霉中表达及其策略研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与设备
•     2.2.1 实验涉及的质粒与菌种
•     2.2.2 引物序列
•     2.2.3 实验涉及材料
•     2.2.4 实验涉及的仪器与设备
•   2.3 实验方法及步骤
•     2.3.1 核酸酶P1的生物信息学分析
•     2.3.2 构建核酸酶P1的表达载体
•     2.3.3 构建质粒转化无孢黑曲霉Bdel4
•     2.3.4 核酸酶P1重组表达转化子的筛选
•     2.3.5 重组表达株的核酸酶P1酶活性检测及蛋白鉴定分析
•   2.4 实验结果与讨论
•     2.4.1 核酸酶P1的结构和性能研究
•     2.4.2 核酸酶P1运用kexlinker、融合蛋白、2A肽多拷贝策略的黑曲霉表达菌株的构建
•     2.4.3 核酸酶P1重组表达株的表达性能研究
•   2.5 本章小结
• 第三章 18S rDNA和28S rDNA介导的核酸酶P1在黑曲霉中的多拷贝表达及拷贝数分析
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料与设备
•     3.2.1 实验涉及的质粒与菌种
•     3.2.2 引物序列
•     3.2.3 实验涉及试剂及试剂盒
•     3.2.4 实验涉及的仪器与设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 18S rDNA和28S rDNA介导的核酸酶P1多拷贝表达载体的构建
•     3.3.2 18S rDNA和28S rDNA介导的核酸酶P1表达质粒转化黑曲霉Bdel4
•     3.3.3 18S rDNA和28S rDNA介导的核酸酶P1重组表达株的表达性能研究
•     3.3.4 qRT-PCR测定核酸酶P1转化子的拷贝数
•   3.4 实验结果与讨论
•     3.4.1 18S rDNA和28S rDNA介导的核酸酶P1重组表达菌株的构建
•     3.4.2 18S rDNA和28S rDNA介导的核酸酶P1重组表达株表达性能研究
•     3.4.3 核酸酶P1重组表达株的Nuc P1基因拷贝数与酶活水平的关系研究
•   3.5 本章小结
• 第四章 重组核酸酶P1的纯化和酶学性质的研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料与设备
•     4.2.1 实验涉及的质粒与菌种
•     4.2.2 实验涉及的材料
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 重组核酸酶P1的His亲和层析纯化
•     4.3.2 重组核酸酶P1分子量大小的鉴定
•     4.3.3 重组核酸酶P1酶学性质研究
•     4.3.4 重组核酸酶P1的应用特性研究
•   4.4 实验结果与讨论
•     4.4.1 重组核酸酶P1的His亲和层析纯化
•     4.4.2 重组核酸酶P1分子量大小的研究
•     4.4.3 重组核酸酶P1酶学性质研究
•     4.4.4 重组核酸酶P1的应用特性研究
•   4.5 本章小结
• 结论与展望
• 本论文创新点
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈筱仪

导师: 潘力,吴新良

关键词: 黑曲霉,核酸酶,重组表达,多拷贝

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华南理工大学

分类号: Q78

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.002761

总页数: 85

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