杂交构树UDP-葡萄糖脱氢酶基因的克隆及特性分析

论文摘要

架杂交构树（Broussonetiakazinoki ×Broussonetiapapyifera）被广泛应用于造纸、饲料、医药等行业,并在扶贫产业、环境保护,生态修复上发挥重要作用。在高等植物中,多糖代谢在调控纤维素、半纤维素、果胶和胼胝质等细胞壁物质的形成、营养器官的生长及生殖器官的发育过程发挥重要作用。尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UGDH）是半纤维素和果胶生物合成途径中的关键酶,其以NAD+为辅酶催化UDP-葡萄糖转化为UDP-葡萄糖醛酸酯（UDP-GlcA）,进而参与植物生长发育的调控。因此,研究杂交构树UGDH基因的功能和表达特性对于该多功能综合性树种的开发利用具有重要意义。本研究从杂交构树中分离UGDH基因及其启动子,并分析BpUGDH的表达模式及功能,同时对低温胁迫和正常生长的杂交构树组织培养苗,进行转录组测序分析,对获得的差异表达基因进行功能注释与归类,构建蛋白质互作网络。旨在提高杂交构树的生长发育和适应性,拓展其栽培区域,并为杂交构树的分子育种提供耐寒性的候选基因。主要结果如下:（1）利用兼并-PCR及RACE技术克隆分离了杂交构树UGDH基因,命名为BpUGDH。BpUGDH基因cDNA包含1443bp的开放阅读框,编码480个氨基酸,其蛋白分子量为53.04kDa,理论等电点为5.98;BpUGDH与苎麻的UGDH亲缘关系较近,定位于叶绿体中。（2）利用Real time Q-PCR技术对BpUGDH基因的表达模式进行调查结果显示,BpUGDH基因在杂交构树的根、茎和叶中均能稳定的表达,且茎中的表达量最高。（3）利用Genome Walking技术从杂交构树基因组中分离了1324bp的BpUGDH基因启动子,利用GUS报告基因深入分析了BpUGDH的表达模式发现,Pro.BpUGDH::GUS在转基因拟南芥幼苗及生长旺盛组织中高效表达,在成熟组织中表达量明显下降,种子中没有检测到该基因的表达。激素诱导和低温胁迫实验证实,Pro.BpUGDH::GUS的表达受乙烯、赤霉素、生长素、茉莉酸甲酯和低温的诱导。（4）利用同源重组方法构建pBI101-BpUGDH双元表达载体,通过农杆菌介导的花絮浸染法遗传转化拟南芥,分析BpUGDH基因的功能。结果显示:BpUGDH基因在拟南芥中的过量表达增加了转基因株系体内可溶性糖的含量,促进了半纤维素和果胶的积累,提高了转基因拟南芥的营养生长,并且四个转基因株系均表现出更强的耐寒能力。（5）杂交构树组培苗进行转录组测序共获得59056条unigenes。通过BLAST软件与常用的6大数据库进行比对分析,结果在NR数据库31358个unigenes有比对结果且与川桑（Morus notabilis）的相似数为最多,达到了60.40%;在Swiss-Prot、Pfam、COG、GO、KEGG 数据库中分别 27426、23431、7957、18183、15574 个 unigenes有比对结果。（6）低温胁迫下杂交构树中筛选出7320个差异unigenes,其中上调表达基因3219个,下调表达基因4101个。差异表达基因的GO功能注释结果显示,催化活性、代谢进程、膜活性、结合活性、细胞进程、单生物进程和覆膜部分中涉及的unigenes较多;1552个基因被注释到KEGG数据库,涉及的通路有124个,富集通路主要集中在新陈代谢部分。（7）利用String 11.0数据库的拟南芥蛋白质互作网络数据为参考,进行差异表达基因的蛋白PPIs预测,筛选出PCNA2、THY-1、DUT1和CDC2等四个互作度较高的蛋白;采用同样的方法从BpUGDH基因功能富集获得的3个基因集中,共筛选出47个基因并进行蛋白互作预测获得了与其具有紧密、相互作用的9个蛋白,并结合转录组测序结果初步探讨了BpUGDH基因提高植物耐寒性机制。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 1 前言
•   1.1 UGDH基因的研究进展
•     1.1.1 UGDH基因的分离及其生物信息学分析研究
•     1.1.2 UGDH基因表达特性研究
•     1.1.3 UGDH基因功能研究
•   1.2 构树的研究进展
•     1.2.1 构树的地理分布及生物学生态学特性
•     1.2.2 研究利用现状
•     1.2.3 开发利用前景
•   1.3 本研究的目的与意义
•   1.4 研究技术路线
• 2 杂交构树UGDH基因的克隆及其生物信息学分析
•   2.1 植物材料培养及实验耗材
•     2.1.1 植物材料及培养
•     2.1.2 感受态细胞及载体
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 BpUGDH基因的克隆
•     2.2.2 BpUGDH基因生物信息学分析
•     2.2.3 BpUGDH基因亚细胞定位分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 BpUGDH基因的克隆
•     2.3.2 BpUGDH基因的生物信息学分析
•     2.3.3 亚细胞定位分析
•   2.4 讨论
•     2.4.1 BpUGDH基因的序列分析
•     2.4.2 杂交构树BpUGDH位于叶绿体
•   2.5 小结
• 3 BpUGDH基因的表达模式分析
•   3.1 植物材料培养及实验耗材
•     3.1.1 植物材料及培养
•     3.1.2 感受态细胞及载体
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 BpUGDH基因的表达特性分析
•     3.2.2 BpUGDH基因启动子的克隆
•     3.2.3 BpUGDH基因启动子序列分析及其功能预测
•     3.2.4 BpUGDH基因启动子功能分析
•     3.2.5 BpUGDH基因启动子5'端缺失片段的功能分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 BpUGDH基因的表达模式分析
•     3.3.2 BpUGDH基因启动子的克隆
•     3.3.3 BpUGDH基因启动子序列分析
•     3.3.4 克隆BpUGDH基因启动子5'端缺失片段
•     3.3.5 5'端缺失片段表达载体构建
•     3.3.6 拟南芥遗传转化、筛选及鉴定
•     3.3.7 转Pro. BpUGDH::GUS基因拟南芥的GUS染色
•     3.3.8 Pro. BpUGDH 5'端缺失片段表达活性分析
•   3.4 讨论
•     3.4.1 BpUGDH基因表达模式分析
•     3.4.2 BpUGDH基因启动子的克隆及序列分析
•     3.4.3 GUS染色及功能初步验证
•     3.4.4 BpUGDH基因启动子的功能缺失分析
•   3.5 小结
• 4 BpUGDH基因的功能分析
•   4.1 植物材料及表达载体
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 pBI101-BpUGDH双元表达载体的构建
•     4.2.2 BpUGDH基因遗传转化拟南芥
•     4.2.3 转基因拟南芥的表型分析
•     4.2.4 转基因拟南芥的耐寒性分析
•     4.2.5 转基因拟南芥的UGDH酶活性检测
•     4.2.6 糖、木质素、纤维素和半纤维素含量的测定
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 pBI101-BpUGDH双元表达载体的构建
•     4.3.2 pBI101-BpUGDH重组质粒转化农杆菌
•     4.3.3 遗传转化拟南芥及转BpUGDH基因拟南芥的筛选鉴定
•     4.3.4 转基因拟南芥的表型分析
•     4.3.5 转基因拟南芥的耐寒性分析
•     4.3.6 转基因拟南芥的UGDH酶活性检测
•     4.3.7 糖、木质素、纤维素和半纤维素含量的测定
•   4.4 讨论
•     4.4.1 转BpUGDH基因拟南芥的表性分析
•     4.4.2 转基因拟南芥的糖、半纤维素、纤维素的含量变化
•     4.4.3 转基因拟南芥的耐寒性
•   4.5 小结
• 5 BpUGDH基因提高植物耐寒性初探
•   5.1 实验方法
•     5.1.1 转录组测序植物材料的制备
•     5.1.2 植物材料的处理、RNA的提取以及文库构建
•     5.1.3 原始数据的组装及评估
•     5.1.4 转录组功能注释
•     5.1.5 差异表达基因的筛选
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 构建杂交构树再生体系
•     5.2.2 转录组测序结果分析
•   5.3 讨论
•     5.3.1 杂交构树再生体系的建立
•     5.3.2 转录组测序产量及组装
•     5.3.3 分析差异表达基因
•     5.3.4 差异表达基因蛋白互作网络分析
•     5.3.5 BpUGDH基因提高植物耐寒性初探
•   5.4 小结
• 6 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 创新点与展望
•     6.2.1 创新点
•     6.2.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 吉仁花

导师: 白淑兰,张文波

关键词: 杂交构树,启动子,半纤维素,遗传改良

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,林业

单位: 内蒙古农业大学

分类号: S792.99;Q943.2

总页数: 123

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