PEDV NSP8与宿主细胞互作蛋白的鉴定及分析

论文摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的接触性传染病,给当前养猪业造成巨大的经济损失。PEDV是单股正链RNA病毒,包含7个开放阅读框,其中ORF1a和ORF1b编码的两个多聚蛋白PP1a和PP1ab能被切割成16个非结构蛋白（Non-structural proteins,NSPs）。这些NSPs具有独特的酶活性,在病毒复制及转录过程中发挥重要的调控作用。为了深入解析PEDV病毒非结构蛋白NSP8与宿主细胞蛋白的互作关系,主要研究内容如下:（1）对SHpd/2012毒株的全基因分析及序列比对得到高度保守的NSP8序列,并制备可特异性识别PEDV NSP8蛋白的高效价多克隆抗体。（2）将猪肾细胞cDNA文库与诱饵质粒pGBKT7-nsp8杂交后,通过选择性培养基筛选及回转实验,在酵母双杂交系统中得到4个与NSP8蛋白存在互作的宿主细胞蛋白:乳酸脱氢酶B链（LDHB）、SERTA结构域3（SERTAD3）、G蛋白信号调节蛋白2（GMS2）和蛋白酶体亚基β型10（PSMB10）,均与细胞内信号通路相关。其中,LDHB能够促进溶酶体酸化后帮助细胞进行自噬,而病毒复制复合物的形成依赖于自噬现象。（3）通过免疫共沉淀和间接免疫荧光确认LDHB与NSP8互作,且NSP8定位于细胞核和细胞质中。本研究通过酵母双杂交技术、免疫共沉淀实验和间接免疫荧光法筛选及鉴定了LDHB与NSP8存在互作,为理解PEDV与宿主细胞蛋白的相互作用机制奠定基础,为阐明PEDV侵染细胞机制提供科学数据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 综述
•   1.1 PED流行病学
•   1.2 PEDV分子病原学特征
•     1.2.1 PEDV结构蛋白
•     1.2.2 PEDV非结构蛋白
•   1.3 PEDV入侵细胞的相关机制
•   1.4 互作蛋白的研究方法
•     1.4.1 酵母双杂交
•     1.4.2 免疫共沉淀
•     1.4.3 其他蛋白质互作的方法
•   1.5 本研究的目的与意义
• 第二章 PEDV NSP8 生物信息学分析、原核表达与多克隆抗体制备
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 毒株、质粒、细胞、实验动物
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 PEDV NSP8 序列分析及蛋白结构预测
•     2.2.2 PEDV NSP8 蛋白的表达鉴定及纯化
•     2.2.3 多克隆抗体的制备
•     2.2.4 多克隆抗体的效价测定
•     2.2.5 多克隆抗体间接免疫荧光法鉴定
•     2.2.6 多克隆抗体Western blot鉴定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 NSP8 序列分析
•     2.3.2 NSP8 蛋白理化性质
•     2.3.3 NSP8 蛋白三级结构及B细胞抗原表位预测
•     2.3.4 重组质粒pET-28a-nsp8 的构建
•     2.3.5 重组蛋白pET-28a-nsp8 的诱导表达
•     2.3.6 重组蛋白pET-28a-nsp8 的蛋白鉴定
•     2.3.7 重组蛋白pET-28a-nsp8 的纯化
•     2.3.8 ELISA测定NSP8 多抗的效价
•     2.3.9 NSP8 多抗的IFA鉴定
•     2.3.10 NSP8 多抗的Western blot鉴定
•   2.4 讨论
• 第三章 猪肾细胞c DNA文库的构建
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 细胞和抗体
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 实验仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 猪肾细胞的培养及接毒
•     3.2.2 PEDV感染猪肾细胞IFA鉴定
•     3.2.3 猪肾细胞总RNA的提取
•     3.2.4 mRNA的分离
•     3.2.5 cDNA文库的构建
•     3.2.6 cDNA文库库容量鉴定
•     3.2.7 cDNA文库质量鉴定
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 PEDV感染猪肾细胞病变观察
•     3.3.2 PEDV感染猪肾细胞IFA鉴定
•     3.3.3 猪肾细胞总RNA的检测
•     3.3.4 mRNA的分离鉴定
•     3.3.5 cDNA文库库容鉴定
•     3.3.6 cDNA文库质量鉴定
•   3.4 讨论
• 第四章 PEDV NSP8与c DNA文库互作的蛋白筛选和验证
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 质粒和感受态
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 实验仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 诱饵质粒的构建
•     4.2.2 酵母双杂交对照实验的建立
•     4.2.3 诱饵质粒毒性检验
•     4.2.4 诱饵质粒自激活检验
•     4.2.5 毒性和自激活实验的评判标准
•     4.2.6 酵母双杂交筛选互作蛋白
•     4.2.7 阳性克隆的PCR鉴定
•     4.2.8 阳性克隆酵母质粒抽提
•     4.2.9 回复杂交验证
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 诱饵质粒pGBKT7-nsp8 的构建
•     4.3.2 酵母双杂交实验阴阳性对照
•     4.3.3 pGBKT7-nsp8 毒性实验
•     4.3.4 pGBKT7-nsp8 自激活验证
•     4.3.5 互作蛋白的筛选
•     4.3.6 阳性克隆的PCR鉴定与序列比对
•     4.3.7 猎物质粒与诱饵质粒pGBKT7-nsp8 回复杂交验证
•   4.4 讨论
• 第五章 PEDV NSP8与LDHB互作鉴定
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 质粒、细胞
•     5.1.2 主要试剂
•     5.1.3 实验仪器
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 重组质粒的构建
•     5.2.2 蛋白的表达及鉴定
•     5.2.3 免疫共沉淀实验
•     5.2.4 IFA实验
•   5.3 实验结果
•     5.3.1 重组质粒pcDNA4.0-nsp8和pcDNA3.1-ldhb的构建
•     5.3.2 NSP8和LDHB蛋白的表达及鉴定
•     5.3.3 CO-IP验证互作关系
•     5.3.4 NSP8和LDHB亚细胞定位
•   5.4 讨论
• 第六章 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 丁思嘉

导师: 杨志彪,李泽君

关键词: 猪流行性腹泻病毒,酵母双杂交,蛋白互作

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 上海交通大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.001417

总页数: 68

文件大小: 2893K

下载量: 41