蛋白质组学揭示希瓦氏菌MR-1在长期六价铬驯化中的还原和耐受机制

论文摘要

六价铬[Cr（VI）]污染引发了一系列严重的环境问题,给地球生物的生存造成了严重的威胁,是目前亟待解决的重金属污染问题。利用微生物将六价铬还原成低毒性的三价铬可以显著地降低六价铬的环境风险。此外,微生物驯化可以在一定程度上提高微生物对六价铬的还原能力和耐受性。目前通过蛋白质组学技术探索由环境压力影响的关键蛋白质或生物过程越来越受到关注。本研究选择Cr（VI）作为目标污染物开展微生物驯化及蛋白质组学研究,研究结果在蛋白质组层面进一步揭示了希瓦氏菌MR-1响应长期Cr（VI）胁迫的还原和耐受能力提高及其性能稳定性的分子机制,有助于我们通过长期的驯化来进行有效的生物修复和环境风险评估,以期为环境污染的防止和治理提供一定的参考。因此,本研究开展了如下两方面工作:第一:在蛋白质组层面,研究了在Cr（VI）浓度递增的环境中驯化120天的希瓦氏菌MR-1在长期Cr（VI）压力下的适应机制。首先,我们对其六价铬还原能力、菌体形貌变化和电化学特征进行了研究,结果表明长期Cr（VI）驯化能够提高希瓦氏菌MR-1对Cr（VI）的还原和耐受能力;扫描电子显微镜（SEM）观察发现菌体发生了形态学改变以适应胁迫环境;微分脉冲伏安（DPV）数据显示菌体电化学氧化还原特征峰也发生了变化。然后,通过定量蛋白质组学串联质量标签（TMT）标记技术对9个实验样本进行了差异分析,共鉴定到2723种蛋白,其中有2500种蛋白被定量。如果以2倍为变化阈值（上调大于2.0倍或者下调小于0.5倍）,且P<0.05为标准。在D120Cr（-）/D120N、D120Cr（+）/D120N和D120Cr（+）/D120Cr（-）三个比较组中分别有239、509和447个差异表达蛋白。生物信息学分析表明,长期Cr（VI）驯化诱导的差异表达蛋白主要与鞭毛组装、核糖体、转运、外排、硫代谢、铁获取和稳态以及能量代谢等功能和过程有关。MR-1的还原能力主要在电子传递系统和能量代谢方面得到增强;而对Cr（VI）的抗性主要通过细胞运动、外排系统、硫酸盐转运、硫代谢、氧化应激保护和能量代谢等方面得到提高。长期驯化的希瓦氏菌MR-1对Cr（VI）的还原主要有胞内和胞外还原;Cr（VI）耐受主要表现在吸收、外排、抗氧化系统和修复系统。第二:驯化120天的菌D120Cr在300 mg/L Cr（VI）和正常环境下继续培养60天,研究其Cr（VI）还原能力和耐受性的稳定性及其内在机制。通过对六价铬还原能力的测定发现正常环境和胁迫环境培养后的菌株对Cr（VI）均有很好的还原和耐受能力,通过扫描电镜观察发现Cr（VI）胁迫使菌株形貌发生了改变。然后,通过Lable-free非标记定量蛋白组学技术对不同环境下培养前后的9个样品进行了Cr（VI）胁迫响应的差异分析,共鉴定到2179个蛋白,其中2146个被定量。根据2倍为变化阈值且P<0.05的标准选择差异蛋白,与一组样品中两次及以上不为空值而另一组所有数据均为空值的差异蛋白一起进行后续生物信息学分析。在D180N/D120Cr、D180Cr/D120Cr和D180N/D180Cr三个比较组中分别有212、459和219个差异表达蛋白。GO功能和KEGG通路注释结果显示D180N/D120Cr、D180CR/D120Cr和D180N/D180Cr三个比较组中差异表达蛋白质涉及的功能和过程非常相似。功能主要涉及催化活性、结合、转运活性、转录调节活性和结构分子活性,主要参与了细胞过程、代谢过程、生物调节、应激响应、定位和生物过程调节等重要生物学过程。GO功能富集结果显示菌株间对高浓度Cr（VI）胁迫的响应差异主要表现在硫酸盐吸收、硫化氢代谢、毒素生物合成、有机N化合物分解代谢、氨基酸分解代谢、半胱氨酸合成、甲酸盐/甲酰胺代谢和咪唑化合物分解代谢等重要生物学过程。KEGG通路富集分析结果表明菌株间对六价铬的响应差异主要体现在戊糖和葡萄糖醛酸酯互变、β-内酰胺抗性、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、CAMP抗性和S代谢等重要的代谢通路,其中S代谢通路尤为重要。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 铬污染及其治理现状
•   1.2 铬的微生物还原及其机理
•   1.3 希瓦氏菌MR-1 及其Cr（Ⅵ）还原
•   1.4 微生物驯化的意义及其研究进展
•   1.5 蛋白质组学技术及其在环境微生物研究中的应用
•   1.6 蛋白质组学常用数据库
•   1.7 研究目的和内容
•     1.7.1 研究目的和意义
•     1.7.2 研究内容
•     1.7.3 技术路线
• 第2章 希瓦氏菌MR-1 在六价铬环境中驯化的还原和耐受机制
•   2.1 材料与仪器
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验试剂及其配制
•     2.1.3 实验仪器与设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 微生物的培养及生长曲线的测定
•     2.2.2 扫描电子显微镜
•     2.2.3 Cr（VI）还原能力的测定
•     2.2.4 电化学测试
•     2.2.5 蛋白质组学细菌样品制备
•     2.2.6 BCA定量法测定蛋白样品浓度
•     2.2.7 SDS-PAGE电泳
•     2.2.8 蛋白质的提取和酶解
•     2.2.9 TMT标记和HPLC分级
•     2.2.10 LC-MS/MS分析
•     2.2.11 数据库搜索
•     2.2.12 生物信息学分析
•   2.3 实验结果与讨论
•     2.3.1 微生物生长曲线及取样点的确定
•     2.3.2 微生物扫描电子显微镜形态
•     2.3.3 微生物对Cr（Ⅵ）的还原能力
•     2.3.4 电化学表征结果
•     2.3.5 蛋白定量和SDS-PAGE电泳图谱
•     2.3.6 蛋白鉴定和比较
•     2.3.7 差异表达蛋白亚细胞结构定位及GO功能分类
•     2.3.8 差异表达蛋白的功能富集和聚类
•     2.3.9 Cr（VI）环境中长期驯化的蛋白质组响应
•     2.3.10 长期Cr（VI）胁迫下的持久性效应
•     2.3.11 短期Cr（VI）刺激的蛋白质组响应
•   2.4 本章小结
• 第3章 D120Cr的 Cr（VI）还原和耐受能力的稳定性研究
•   3.1 材料与仪器
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验试剂及其配制
•     3.1.3 实验仪器与设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 微生物的培养及生长曲线的测定
•     3.2.2 扫描电子显微镜
•     3.2.3 Cr（VI）还原能力的测定
•     3.2.4 蛋白质组学细菌样品制备
•     3.2.5 BCA定量法测定蛋白样品浓度
•     3.2.6 SDS-PAGE电泳
•     3.2.7 蛋白质的提取和酶解
•     3.2.8 LC-MS/MS数据采集
•     3.2.9 蛋白质鉴定和定量分析
•     3.2.10 生物信息学分析
•   3.3 实验结果与讨论
•     3.3.1 150天菌种Cr（VI）还原能力及培养基pH变化
•     3.3.2 180天菌种Cr（VI）还原能力及培养基pH变化
•     3.3.3 微生物生长曲线
•     3.3.4 微生物扫描电子显微镜形态
•     3.3.5 蛋白定量和SDS-PAGE电泳图谱
•     3.3.6 质量控制
•     3.3.7 蛋白鉴定和比较
•     3.3.8 差异表达蛋白质聚类分析
•     3.3.9 差异表达蛋白质GO功能注释和分类
•     3.3.10 差异表达蛋白质GO功能富集分析
•     3.3.11 差异表达蛋白质KEGG通路富集分析
•     3.3.12 蛋白质相互作用网络分析
•   3.4 本章小结
• 第4章 结论与展望
•   4.1 结论
•   4.2 创新点
•   4.3 展望
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间发表的学术论文
• 附录B
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 冮海银

导师: 杨朝晖,肖勇,赵峰

关键词: 希瓦氏菌,六价铬,长期驯化,差异表达蛋白,蛋白质组学

来源: 湖南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 湖南大学

分类号: X172;X703

DOI: 10.27135/d.cnki.ghudu.2019.002086

总页数: 141

文件大小: 8375K

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