脂肪酶亚细胞定位及其生物柴油催化与合成

论文摘要

生物柴油（主要成分为脂肪酸甲酯）作为生物燃料的代表,其生物催化与生物合成是学术界与工业界共同关注的焦点之一。目前生物柴油的生物催化大多采用将脂肪酶催化剂制备与转酯化反应分开的两步策略,反应过程易受副产物甘油的抑制;而生物合成大多采用产油量有限的大肠杆菌或酿酒酵母作为宿主,基于脂肪酸代谢途径改造的胞质从头合成策略。本研究针对目前生物柴油催化与生物合成中的制约问题,采用产油解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为宿主,通过脂肪酶体外生物催化与体内生物合成,基于表面展示构建脂肪酶制备-生物柴油催化整合的原位碳源新型体系,基于脂肪酶的亚细胞定位构建新型生物柴油生物合成体系,为生物柴油的生物催化与生物合成提供新思路。因此本研究将疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶（Thermomyces lanuginosus lipase,TLL）与Y.lipolytica表达载体结合,分别定位于酵母细胞壁表面、胞质以及与油脂代谢相关的细胞器（内质网、过氧化物酶体和油脂体）上,在摇瓶发酵过程中添加甲醇（表面展示型体系还需要添加油脂）,评估生物催化与生物合成脂肪酸甲酯（Fatty acid methyl ester,FAMEs）得率。主要研究工作如下:（1）通过锚定蛋白CWP110将TLL定位于酵母细胞壁表面,利用外源添加的油脂与甲醇,将脂肪酶表达制备与生物柴油催化整合于摇瓶发酵过程。副产物甘油可以作为原位碳源进一步促进细胞生长与脂肪酶表达。消耗甘油的同时减轻了产物反馈抑制,推动反应向生成FAMEs的方向进行,从而形成以甘油为原位碳源的整合FAMEs持续合成生物催化体系。与相应的表面展示静息态细胞相比,该原位碳源整合体系FAMEs的转化率从81%提高到91%,副产物甘油含量从14%下降到3%,细胞密度(OD600)从62增加到71,酶活从1.21 U/mg提高到1.58 U/mg,表明原位碳源整合体系能够有效催化合成生物柴油。（2）通过特异标签将TLL分别定位于胞质、过氧化物酶体、内质网、油脂体,构建四种工程菌。利用外源添加的甲醇与内源油脂,在酵母体内由脂肪酶催化产生FAMEs。结果表明,当脂肪酶定位于细胞器时,FAMEs的转化率高于脂肪酶定位于胞质时的转化率,而且定位于油脂体的工程菌转化率与得率最高,转化率达到了9.72%,得率为23.81mg/L。表明相对于胞质,脂肪酶亚细胞定位有利于生物柴油的催化合成。（3）通过提高Y.lipolytica的油脂含量进一步提高FAMEs得率。油脂积累的代谢途径中有三种关键酶:乙酰辅酶A羧化酶—催化脂肪酸合成的第一步;二酰基甘油酰基转移酶—催化三酰基甘油（Triacylglycerol,TAG）合成的最后一步;TAG合成过程中起关键作用的甘油醛3-磷酸脱氢酶。三种关键酶共表达将油脂积累量从14.18mg/g提高到25.33mg/g,油脂含量提高后再将TLL定位于胞质和细胞器比较FAMEs得率,结果表明定位于油脂体的工程菌FAMEs得率最高,达到了41.72mg/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 微生物脂肪酶概述
•   1.2 脂肪酶体外生物催化制备生物柴油
•   1.3 微生物体内合成生物柴油
•   1.4 产油解脂耶氏酵母
•   1.5 研究背景及意义
• 2 表面展示型脂肪酶原位碳源发酵体系生物催化制备生物柴油
•   2.1 实验材料
•   2.2 实验方法
•   2.3 结果与分析
•   2.4 讨论与小结
• 3 脂肪酶的细胞器定位及生物柴油生物合成
•   3.1 实验材料
•   3.2 实验方法
•   3.3 结果与分析
•   3.4 讨论与小结
• 4 TAG合成过程限速酶的共表达及脂肪酶定位型细胞生物合成生物柴油
•   4.1 实验材料
•   4.2 实验方法
•   4.3 结果与分析
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 5 全文总结与展望
•   5.1 总结
•   5.2 不足与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 附录2 基因序列

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 乔阳歌

导师: 阎金勇

关键词: 脂肪酶,解脂耶氏酵母,细胞器定位,油脂,脂肪酸甲酯,生物催化与生物合成

来源: 华中科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,燃料化工,石油天然气工业

单位: 华中科技大学

分类号: TE667;Q55

DOI: 10.27157/d.cnki.ghzku.2019.003609

总页数: 99

文件大小: 3709K

下载量: 57