家蚕ADA3蛋白在杆状病毒侵染过程中调控机制的研究

论文摘要

家蚕（Bombyx mori）是一种鳞翅目模式昆虫,家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是一类专一性侵染家蚕的病毒,该病毒的侵染是造成蚕丝业损失的重要原因之一,但二者的相互作用机制尚未完全阐明。为了深入了解它们之间的互作调控关系,我们在前期的实验中分析了 BmNPV侵染前后细胞中蛋白质组学和乙酰化修饰组学的变化情况,结果显示家蚕ADA3（alteration/deficiency in activation 3）蛋白的表达水平在病毒感染后显著增加了66%且乙酰化水平显著降低了 34%。已有的研究结果表明:该蛋白具有多种生物学功能,在细胞增殖、细胞凋亡等过程中均发挥重要作用,但其在家蚕细胞中的生物学功能,尤其是在病毒-宿主互作过程中的作用机制还未见报道。鉴于此,本课题选择家蚕ADA3蛋白作为研究对象,在基于分析其生物学功能的基础上,研究了它在病毒侵染过程中的调控机制。首先,对家蚕ada3基因进行了生物信息学分析,发现该基因的开放阅读框全长为1383 bp,共编码460个氨基酸,有一个羧基端保守结构域---ADA3。然后克隆了家蚕ada3基因并在大肠杆菌中进行诱导表达、纯化,制备了多克隆抗体。利用构建的瞬时表达载体pIEx-1-ada3转染BmN细胞,Western Blot结果显示在转染24h后目的蛋白即开始表达,并于转染后48h达到峰值。MTT检测结果表明ADA3蛋白的过表达可显著增强细胞活力,Western Blot、DNA片段化和流式细胞术检测结果也进一步显示ADA3蛋白的过表达可在一定程度上抑制宿主细胞凋亡。此外,亚细胞定位分析结果表明家蚕ADA3蛋白主要定位于细胞核中。Western Blot检测结果显示ADA3过表达细胞内的Cyclin D1蛋白表达量呈下降趋势,但随着病毒感染时间的延长,Cyclin D1蛋白的表达量逐渐增加,说明家蚕ADA3蛋白的过表达可能促进G1期向S期的转换。利用qPCR技术分析了病毒基因组的复制水平,结果显示ADA3蛋白的过表达在一定程度上可抑制病毒的复制,尤其是在病毒复制的早期。最后,利用构建的模拟乙酰化和去乙酰化的过表达载体转染BmN细胞,其DNA片段化结果显示该蛋白K124位点的去乙酰化修饰可显著提高细胞的凋亡水平。综上所述,可知家蚕ADA3蛋白具有增强细胞活力、抑制细胞凋亡、促进细胞G1期向S期的转换以及抑制病毒的复制等生物学功能,其K124位点的（去）乙酰化修饰对杆状病毒侵染诱导的宿主细胞凋亡水平具有显著的调控作用。本研究将为深入研究杆状病毒与家蚕宿主间的互作调控机制奠定基础,同时也将为家蚕病毒性疾病的防治提供新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 绪论
•   1 家蚕杆状病毒与宿主的相互作用
•   2 ADA3蛋白的研究进展
• 第二章 实验方案
•   1 研究目的和意义
•   2 研究的主要内容
•   3 技术路线
• 第三章 家蚕ADA3的生物信息学分析及其基因的克隆
•   1 实验材料与试剂
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验试剂
•     1.3 主要试剂的配制
•   2 实验方法
•     2.1 家蚕ADA3蛋白的生物信息学分析
•     2.2 家蚕ada3基因的克隆
•   3 实验结果与分析
•     3.1 家蚕ADA3蛋白的生物信息学分析
•     3.2 家蚕ada3基因的克隆
•   4 讨论
• 第四章 家蚕ADA3蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备
•   1 实验材料与试剂
•     1.1 实验材料
•     1.2 试剂
•     1.3 主要试剂的配制
•   2 实验方法
•     2.1 家蚕ADA3蛋白的诱导表达
•     2.2 SDS-PAGE电泳分析诱导表达产物
•     2.3 ADA3蛋白的纯化
•     2.4 多克隆抗体的制备
•   3 实验结果与分析
•     3.1 ADA3重组蛋白的诱导表达和纯化
•     3.2 多克隆抗体的特异性检测
•   4 讨论
• 第五章 家蚕ADA3蛋白对细胞活力和细胞凋亡的影响
•   1 实验材料与试剂
•     1.1 细胞
•     1.2 材料与试剂
•     1.3 主要试剂的配制
•   2 实验方法
•     2.1 家蚕ADA3蛋白的表达时相分析
•     2.2 检测家蚕ADA3蛋白的过表达对细胞活力的影响
•     2.3 检测家蚕ADA3蛋白过表达对细胞凋亡的影响
•   3 实验结果与分析
•     3.1 家蚕ADA3蛋白的过表达时相分析
•     3.2 家蚕ADA3蛋白的过表达对细胞活力的影响
•     3.3 家蚕ADA3蛋白的过表达对细胞凋亡的影响
•   4 讨论
• 第六章 家蚕ADA3蛋白对细胞周期和病毒复制的影响
•   1 实验材料与试剂
•     1.1 细胞
•     1.2 材料与试剂
•     1.3 主要试剂的配制
•   2 实验方法
•     2.1 家蚕ADA3蛋白的亚细胞定位研究
•     2.2 检测家蚕ADA3蛋白的过表达对细胞周期的影响
•     2.3 检测家蚕ADA3蛋白的过表达对病毒复制的影响
•   3 实验结果与分析
•     3.1 家蚕ADA3蛋白的亚细胞定位分析
•     3.2 家蚕ADA3蛋白的过表达对细胞周期的影响
•     3.3 家蚕ADA3蛋白的过表达对病毒复制的影响
•   4 讨论
• 第七章 家蚕ADA3蛋白的乙酰化修饰对细胞凋亡的影响
•   1 实验材料与试剂
•     1.1 细胞
•     1.2 材料与试剂
•     1.3 主要试剂的配制
•   2 实验方法
•     2.1 家蚕ADA3蛋白的乙酰修饰化对细胞凋亡的影响
•   3 实验结果与分析
•     3.1 家蚕ADA3蛋白的乙酰化修饰对细胞凋亡的影响
•   4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 闫慧慧

导师: 于威

关键词: 家蚕,细胞凋亡,细胞周期,病毒复制

来源: 浙江理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江理工大学

分类号: Q78

DOI: 10.27786/d.cnki.gzjlg.2019.000032

总页数: 75

文件大小: 4363K

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