双性基因论文_段建平

导读:本文包含了双性基因论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:基因,家蚕,论文。

双性基因论文文献综述

段建平^[1]（2013）在《家蚕双性基因dsx新拼接形式的鉴定及对A8腹节两性发育的调控》一文中研究指出家蚕作为鳞翅目昆虫典型代表,其性别调控机理的深刻阐释可为单养雄蚕和鳞翅目害虫防治提供理论依据。但遗憾的是,家蚕性别调控机制的研究还处于起步阶段,从上游性别决定初始信号,到中游性别决定关键基因,再到下游性别决定双性基因如何调控两性异型等等,都不十分清楚。基于比较基因组学和现代分子生物学实验方法鉴定家蚕性别决定信号通路中的重要基因,要么同源基因不存在,要么同源基因存在,但功能验证很可能不是性别决定信号通路上的关键基因,因此结果都不十分理想。到目前为止,唯一被证实参与家蚕性别调控的重要基因是Bmdsx。Bmdsx作为双性基因,处在性别调控信号通路的最下游,其雌雄差异表达既受中游家蚕性别决定未知关键基因的调控,同时又影响家蚕雌雄分化相关基因的表达,因此基于Bmdsx开展相应的研究工作,很可能是揭示家蚕性别决定和表型分化机制的突破口。据报道Bmdsx有6个外显子,经选择拼接产生2个雌拼接体和1个雄拼接体,但我们在对Bmdsx的雌雄表达模式进行调查时,发现该表达模式与理论推测的不一致。为了弄清Bmdsx的雌雄表达模式,并探索其对两性异型的调控机制,我们首先对Bmdsx可能存在的拼接体进行深入调查,并对其基因组结构和表达模式进行分析,然后对家蚕中可能存在几种具有潜在调控能力的Dsx蛋白进行分析,并用转基因技术对这些Dsx蛋白进行功能验证,最后探索Bmdsx对第8腹节(A8)两性发育的调控。获得的主要结果如下：1. Bmdsx新拼接形式的鉴定RT-PCR检测Bmdsx的表达情况时发现雌雄组织中有多条扩增条带,测序分析发现这些条带都是Bmdsx的不同拼接体。进一步3'RACE克隆发现Bmdsx确实有多种拼接形式存在,至此共鉴定到19种选择拼接体和10种反式拼接体。与基因组数据比对分析,发现Bmdsx共有9个外显子,其中外显子2n、3n和6n是新外显子,它们有可能是进化过程中新获得的外显子；第5内含子选择不同的5'或3'拼接位点,会导致不同拼接体中第3、4外显子的长度不同；进一步对其外显子内含子边界分析发现除6n外显子外,其它外显子5'端都是强的拼接位点,可能需要拼接抑制因子与之结合来调控雌雄差异拼接,只有6n外显子5'拼接受体位点是弱的拼接位点,类似Dmdsx第4外显子5'端,可能需要拼接增强因子与之结合。2.反式拼接是Bmdsx新拼接方式在分析拼接体Bmdsx-dsr1和Bmdsx-dsr2的结构时,发现这两个拼接体的3'端不是来自Bmdsx,前者的3'端与Bmdsx同位于第25号染色体上,且与Bmdsx紧密连锁；而后者的3'端位于第16号染色体上,其产生应该是反式拼接的结果。进一步克隆了Bmdsr1,发现它共有8个转录本,只有转录本Bmdsr1a可与BmdsxF1经反式拼接产生Bmdsx-dsr1反式拼接体。在调查Bmdsr1和Bmdsr2是否与其它Bmdsx拼接体发生反式拼接时,发现Bmdsx-dsr1的表达无法检测,可能是拼接噪音；而Bmdsx-dsr2在多个雌蚕组织,如表皮、脂肪体、气管和丝腺中都有表达,具有雌特异性特征,在两性生殖腺中虽都有表达,但进一步测序分析显示精巢中的两个反式拼接体是Bmdsr2与Bmdsx雌拼接体发生反式拼接的结果,且结构分析也显示Bmdsr2只与Bmdsx雌拼接体,如BmdsxF1、BmdsxF2、BmdsxF3发生反式拼接。细胞转染也暗示Bmdsr2与Bmdsx雌拼接体发生反式拼接后,改变了Bmdsx的3'UTR区,降低Bmdsx雌拼接体mRNA翻译蛋白的效率。因此,反式拼接是Bmdsx的新拼接方式,Bmdsr2可能是Bmdsx表达调控的新附加基因,通过反式拼接只影响雌蚕体细胞的发育。3. Bmdsx的雌雄差异表达及其编码蛋白序列分析在Bmdsx不同外显子上设计特异引物,检测不同拼接体或外显子在雌雄各组织中的拼接利用情况。结果显示：雄拼接体在雄蚕组织中特异表达,雌拼接体在雌蚕组织中高量表达,但在雄蚕组织中有极微弱表达。新外显子2n在雌雄各组织中都有拼接利用,是雌雄共用外显子；新外显子3n只在雌蚕组织中被拼接,是雌特异外显子；新外显子6n只在雄蚕的头、中肠、马氏管、气管、精巢及雌的卵巢中有拼接利用,具有一定的雄偏向性特征,进一步测序分析6n外显子的所有拼接条带,又发现另外3个新选择拼接体的存在,其中1个为雌拼接体,2个为雄拼接体,到此共在家蚕体内鉴定到22种选择拼接体；第3外显子3'端向外延伸15bp在雌蚕各组织中都存在,同第4外显子5'端向外延伸127bp,可能都受性别决定信号通路中游关键基因的调控。为验证家蚕体内有多少种Dsx功能蛋白,进一步对22种选择拼接体可能编码多少种具有潜在调控能力的Dsx蛋白进行分析。发现Bmdsx的22种选择拼接体只可能编码5种雌Dsx蛋白、4种雄Dsx蛋白和4种未分类Dsx蛋白,存在多个选择拼接体共编码同一Dsx蛋白的情况,这些拼接体区别仅在3'UTR区,暗示选择利用不同的3'UTR可能是Bmdsx表达调控的一种方式。氨基酸序列分析显示上述13种Dsx蛋白中,只有4种雌Dsx蛋白、2种雄Dsx蛋白以及1种未分类Dsx蛋白可能对下游靶基因具有潜在的调控能力。4种雌Dsx蛋白具有不同C末端,可能影响Dsx蛋白对下游靶基因的激活或抑制效率。第2n外显子的获得导致在DBD/OD1和DBD/OD2之间插入27aa的多肽,但此多肽的插入并未改变两DNA结合结构域的完整性,可能只影响Dsx蛋白与下游靶基因启动子区的结合能力。4. Bmdsx转基因品系的建立及对下游靶基因表达的影响利用转基因技术对上述4种雌Dsx蛋白和2种雄Dsx蛋白进行功能验证。首先成功构建了6个转基因表达载体,经显微注射、荧光筛选、基因组反向PCR及Southern blot检测,建立了6个转基因品系,共获得12个不同插入位点、各发生1-2次转座事件的转基因。数据统计分析发现,6个转基因品系的G1代雌雄个体性别比例都未偏离1：1的性别比例。遗传判性分析显示所有G1代个体染色体组型与外部性表型一致,未发现性反转个体的存在。3'RACE及RT-PCR结果显示外源Bmdsx都被成功驱动表达。定量PCR分析显示：当在雄蚕中单一过表达雌Dsx蛋白时,可促进SP1和Vg在脂肪体中的表达,并降低PBP在触角中的表达水平；当在雌蚕中单一过表达雄Dsx蛋白时,可抑制SP1和Vg在脂肪体中的表达,并提高PBP在触角中的表达水平,表明具有潜在调控能力的4种雌Dsx蛋白和2种雄Dsx蛋白都能调控叁个已知Bmdsx下游靶基因的表达,暗示4种雌Dsx蛋白和2种雄Dsx蛋白具有调控雌雄发育相关基因表达的能力,应该都参与家蚕体细胞的性别发育。5. BmdsxM异位表达引起雌蛾第8腹节发育异常家蚕雌雄蛾尾部形态呈现两性异型特征,即雌蛾尾部具有几丁质样锯齿板,附着于生殖节上,而雄蛾中对应部位则是被大量鳞毛覆盖的A8腹节。选取加秋、大09和301叁个蚕品种,检测其雌雄蛾尾部Erk蛋白的磷酸化水平,发现不同蚕品种雌蛾尾部Erk蛋白磷酸化水平都显着低与雄蛾尾部,趋势都相同,暗示RTK信号通路的活性程度对家蚕幼虫第8腹节表皮处成组织细胞的两性发育有影响。家蚕雌雄蛾交配时,只有雄蛾抱器钩住雌蛾锯齿板,交配才能顺利进行。在观察上述6个转基因品系时,发现ssd-6-2转基因雌蛾,从G1代到G6代,其所有雌蛾的交配行为出现异常,都交配不能,因此不能产生后代；细致观察发现ssd-6-2转基因雌蛾尾部生殖节发育异常,具有雄性化特征,锯齿板表面被大量鳞毛附着,暗示BmdsxMI在雌蚕中的异位表达,影响了雌蚕幼虫第8腹节表皮处成组织细胞向锯齿板方向的发育。检测四个蚕品种非转基因雌雄蛾尾部Erk蛋白的磷酸化水平差异,发现雄蛾尾部Erk蛋白磷酸化水平极显着高于雌蛾尾部；进一步检测Erk蛋白在转基因雌蛾尾部的磷酸化水平时,发现Erk蛋白的磷酸化水平被显着提高,趋向雄蛾,强烈暗示RTK信号通路的活性程度影响雌蛾A8腹节的正常发育。深入分析RTK信号通路相关基因在转基因雌蛾尾部的表达水平,发现EGFR信号通路上游配体基因spi,配体加工蛋白基因star和rho,调控二聚化受体内吞过程的叁个基因cbI、mop和hrs,负反遗调节的一个基因kekl,以及下游5个细胞周期蛋白基因cyclinA、cyclinB、cyclinD、cyclinE和cyclinL的表达量都发生变化,都趋向于雄蛾,暗示EGFR信号通路的激活诱导了雌蛾A8腹节的雄性化发育。最后,我们也检测了Abd-B基因的表达水平,发现此基因在转基因雌蛾尾部的表达被诱导并趋向雄蛾尾部,暗示Hox基因也参与家蚕A8腹节的二向性发育。(本文来源于《西南大学》期刊2013-04-10）