snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体积累的机制研究

论文摘要

自噬（autophagy）是一类进化上保守的细胞内降解过程,主要是将细胞内老化或多余的细胞成份运送到溶酶体中进行降解。具有双层膜结构的自噬小体包裹着自噬底物,与内吞小体及溶酶体融合或者直接与溶酶体融合,随后自噬小体包裹的自噬底物被溶酶体中的水解酶降解,降解过程释放的能量以及降解后产生的氨基酸小分子可以被细胞重新利用。自噬在维持细胞内稳态、生长发育、免疫能力、分化重建中也具有重要的作用。分选蛋白（SNXs）能够在胞内完成转运蛋白的分拣,进而对内吞体进行精细调控。分选连接蛋白3（sorting nexin 3,SNX3）是SNXPX类蛋白的一个成员,目前研究的最多的功能是SNX3调控细胞内蛋白转运,内吞体成熟与分选等,SNX3在自噬过程中的作用还没有被很好的探究。有研究表明线虫（C.elegans）体内snx-3基因突变后会造成一系列发育障碍。我们利用成像研究观察到snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体相关结构的标记蛋白LGG-1蛋白出现明显积累,生化结果也表明GFP::LGG-1含量增多。ATG-13、BEC-1和ATG-7在自噬小体的形成过程中发挥着重要作用,我们利用成像技术观察到snx-3分别与atg-13,bec-1以及atg-7双突变的线虫肠细胞中LGG-1的含量明显减少,表明snx-3（tm1595）线虫肠细胞中LGG-1增多是由于自噬活动导致。因此我们以秀丽线虫为模式生物,探究了snx-3（tm1595）线虫肠细胞中LGG-1增多的原因。我们首先想知道snx-3（tm1595）线虫体内自噬通量（autophagic flux）的水平,自噬通量可以衡量细胞降解活性。使用mCherry::GFP::LGG-1标记区分自噬小体与自噬溶酶体,我们观察到snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体含量明显升高,自噬溶酶体含量没有明显变化,推测snx-3（tm1595）线虫体内自噬通量下降。自噬底物W07G4.5聚集体增多证明snx-3（tm1595）线虫体内自噬通量下降。我们分别对snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体的生成、自噬小体与溶酶体的融合和自噬小体在溶酶体中的降解三个阶段进行检测。干扰CUP-5的表达或者使用Baf A1处理破坏溶酶体的功能后,snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体没有进一步升高,而且snx-3突变后daf-2（e1370）线虫体内LGG-1的含量升高,表明SNX-3不参与自噬早期阶段中自噬小体的生成,snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体没有被诱导增多。Baf A1处理后不影响snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体和自噬溶酶体的分布,表明snx-3（tm1595）线虫体内自噬小体与溶酶体的融合或者自噬小体在溶酶体中的降解存在障碍。通过统计比较与溶酶体融合的自噬小体所占的比例,我们发现snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体与溶酶体融合减慢。LysoTracker可以检测并反映溶酶体的酸性情况和功能强弱,使用LysoTracker标记溶酶体我们观察到snx-3（tm1595）线虫肠细胞中溶酶体功能正常。另外,通过饥饿诱导自噬观察LGG-1标记的自噬结构蛋白的降解,我们发现snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体在溶酶体中的降解正常。总之,本论文工作证明了snx-3（tm1595）线虫体内自噬通量降低,降解活性下降。snx-3（tm1595）线虫肠细胞中积累的LGG-1主要是因为自噬晚期阶段自噬小体与溶酶体的融合速率减慢。本文初步探究证明了在线虫中SNX-3可以通过影响自噬过程中自噬小体与溶酶体的融合过程参与自噬过程,这为进一步研究SNX-3在自噬过程的具体作用分子机制提供了基础和参考依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 自噬
•   1.2 SNX蛋白简介
•   1.3 模式生物线虫
•   1.4 本文研究的出发点和主要内容
• 2 实验原理和研究方法
•   2.1 RNA干扰技术
•   2.2 激光共聚焦显微成像技术
•   2.3 显微微量注射技术
•   2.4 线虫的培养方法
•   2.5 线虫的杂交
•   2.6 质粒的构建
•   2.7 WESTERN BLOT生化实验
• 3 实验结果
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料和方法
•   3.3 实验结果与讨论
• 4 总结与展望
• 致谢
• 参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张娜丽

导师: 张蓉颖

关键词: 自噬,蛋白,自噬通量,溶酶体

来源: 华中科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华中科技大学

分类号: Q25

DOI: 10.27157/d.cnki.ghzku.2019.002013

总页数: 77

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