菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究

论文摘要

佐剂已经成为亚单位疫苗不可或缺的重要组成部分,同时也是制约亚单位疫苗发展的重要因素。目前临床使用的佐剂数量有限,而且还存在不同程度的不良反应,因此,亟待开发更加安全有效的亚单位疫苗佐剂。菊糖（Inulin）是由D-果糖经β-1,2糖苷键连接而成的一种天然果糖聚合物,其来源广泛、价格低廉、安全性高、生物相容性好,而且具有免疫调节功能。因此,菊糖具有作为亚单位蛋白疫苗佐剂的良好潜力。为了研究菊糖对亚单位蛋白疫苗的佐剂效果,制备了基于菊糖化学修饰的结核分枝杆菌疫苗和寨卡病毒疫苗,通过研究两种疫苗的免疫原性,分别评价菊糖在细菌性疫苗和病毒疫苗中的佐剂作用。目前疫苗佐剂的递送主要利用物理混合的方法,根据静电吸附或微球包裹的原理加载抗原。但由于菊糖呈电中性,因此不能直接吸附抗原,而使用额外的添加材料包裹菊糖和抗原,可能会引起机体非特异性免疫应答,并造成一定的安全性问题。为了弥补上述传统方法带来的缺陷,采用化学修饰的方法,将抗原和佐剂共价结合,使得抗原与佐剂同时到达抗原提呈细胞（APCs）,从而增强细胞对抗原的摄取,刺激机体产生更强的免疫应答。菊糖与蛋白抗原共价结合成为一种新型的抗原递送系统,可以形成半衰期较长的亚单位疫苗。通过探讨菊糖与免疫系统的相互作用机制,研究菊糖对疫苗的佐剂作用。全文的主要研究结果如下:（1）菊糖在结核分枝杆菌亚单位蛋白疫苗中具有良好的佐剂效果首先,表达并纯化得到一种结核分枝杆菌抗原融合蛋白,即CFP10-TB10.4融合蛋白（CT）。菊糖与载体蛋白CRM197共价结合成CRM-inu。然后将结合物（CRM-inu）与CT结合形成亚单位疫苗CT-CRM-inu,研究此亚单位疫苗的免疫原性和药代动力学特性。在BALB/c小鼠的体内试验表明,CRM-inu修饰使CT特异性IgG抗体滴度显著升高。与CT组相比,CT-CRM-inu组的CT特异性IgG滴度在第14天、21天、28天分别增加了11.0倍（P<0.05）、8.6倍（P<0.05）、20.6倍（P<0.05）;与此同时,CT-CRM-inu组Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α在脾脏淋巴细胞中的表达分别增强了24.1（P<0.05）和2.4倍（P<0.05）;Th2型细胞因子IL-5和IL-10在脾脏淋巴细胞中的表达分别增强了7.8倍（P<0.05）和3.5倍（P<0.05）,这表明CRM-inu共价修饰能够提高机体CT蛋白特异性的体液免疫和细胞免疫应答。此外,重要的是研究证明小鼠血清样本中未检测出抗菊糖抗体,菊糖佐剂自身免疫原性极低,具有良好佐剂潜力。菊糖修饰的CT蛋白对小鼠心、肝和肾功能没有明显影响,具有良好的安全性。为了进一步研究菊糖的佐剂作用机制,测定了菊糖佐剂修饰的疫苗在SD大鼠体内的药代动力学特征。结果表明,通过CRM-inu修饰,与CT组相比,CT-CRM-inu组的血浆半衰期7.0±0.2 h延长至26.4±0.1 h,药时曲线下面积AUC0-144 h由1228.5±323.5μg mL-1h-1增加至7284.4±535.1μg mL-1h-1,生物利用度的清除率Cl/F由0.32±0.02μg/μg mL-1h-1下降至0.15±0.02μg/μg mL-1h-1。由此可知,CRM-inu修饰可显著延长CT在免疫系统中的暴露时间,提高疫苗的吸收利用程度,降低CT在血清中的清除速率,达到诱导机体产生更强烈的CT特异性免疫应答的目的。（2）菊糖作为寨卡病毒亚单位蛋白疫苗E蛋白佐剂具有良好的效果首先表达并纯化得到作为抗原的寨卡病毒包膜蛋白（E蛋白）。为了提高E蛋白的免疫原性,选用TLR7受体激动剂洛索立宾（Loxoribine,Lox）,与菊糖共同修饰E蛋白,制备了一系列集免疫刺激分子、递送系统以及抗原为一体的新型E蛋白亚单位疫苗Lox-E-inu。疫苗的免疫原性和免疫机理研究结果表明:菊糖协同洛索立宾作为E蛋白的佐剂,可诱导E蛋白的特异性IgG抗体产生以及T细胞反应。与单独的E蛋白组相比,Lox-E-I1组在第7天、第14天和第21天的特异性IgG滴度分别增加了4.0倍（P<0.05）、9.5倍（P<0.05）和25.0倍（P<0.05）。Lox-E-inu组Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2以及Th2型细胞因子IL-10的脾淋巴细胞数目分别增加了2.8倍（P<0.05）、1.5倍（P<0.05）、1.9倍（P<0.05）和1.8倍（P<0.05）;提高了CD4+T亚群细胞（P<0.05）和CD8+T亚群细胞（P<0.05）的数量,而CD4+T和CD8+T细胞数的比值并没有显著的变化（P>0.05）。此外,血清样本中没有检测出抗菊糖抗体,表明菊糖自身的免疫原性极低,具有良好的佐剂潜力。为进一步探讨菊糖和Lox的佐剂作用机理,采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对DC细胞的荧光强度进行分析发现,Lox-E-inu组树突状细胞（imDC细胞）摄取FITC标记疫苗的比率（56.97%）要显著高于单独E蛋白组（11.81%）,平均荧光强度（94.82）高于单独E蛋白组（12.26）,证实菊糖协同Lox佐剂能促进imDC细胞对抗原的高效摄取。此外,疫苗Lox-E-inu接种对小鼠心、肝和肾功能没有明显影响。上述研究结果表明,菊糖和Lox偶联递送E蛋白是增强体液免疫和细胞免疫的有效策略,其主要机制是通过提高imDC细胞对抗原的摄取,促进imDC细胞的分化与成熟,有利于提高DC细胞对抗原的递呈效率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1 概述
•   2 菊糖的研究进展
•     2.1 菊糖的结构
•     2.2 菊糖的理化性质
•     2.3 影响菊糖结构和含量的天然因素
•     2.4 菊糖的天然来源及提取
•     2.5 菊糖在植物中的功能
•     2.6 菊糖在功能食品中的应用
•     2.7 菊糖在药物中的应用
•     2.8 菊糖的免疫调节功能
•     2.9 菊糖的佐剂作用
•   3 亚单位疫苗佐剂研究进展
•     3.1 亚单位疫苗佐剂的重要性及其作用机制
•     3.2 亚单位疫苗佐剂的分类
•     3.3 亚单位疫苗递送系统
•     3.4 目前被批准使用的佐剂
•     3.5 目前佐剂的安全性及局限性
•     3.6 高效佐剂的策略
•   4 结核病及结核分枝杆菌疫苗
•     4.1 结核病流行现状
•     4.2 结核分枝杆菌简介
•     4.3 结核分枝杆菌疫苗卡介苗
•     4.4 新型结核病疫苗研制策略
•   5 寨卡病毒流行病学特征及疫苗进展
•     5.1 寨卡病毒生物学特征
•     5.2 寨卡病毒致病机制
•     5.3 寨卡病毒免疫应答特征
•     5.4 寨卡疫苗研究进展
•     5.5 寨卡疫苗研究挑战
•   6 本论文研究的目的意义及主要研究内容
•     6.1 本论文研究的目的意义
•     6.2 本论文研究的主要内容
• 第二章 菊糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备
•   1 材料与方法
•     1.1 主要材料与试剂
•     1.2 主要仪器与设备
•     1.3 试验方法
•   2 结果与分析
•     2.1 融合蛋白CFP10-TB10.4的表达、纯化和鉴定
•     2.2 分子排阻色谱纯化 CFP10-TB10.4 融合蛋白疫苗
•     2.3 CFP10-TB10.4蛋白疫苗的质量控制
•     2.4 分子排阻色谱分析纯化后的CFP10-TB10.4融合蛋白疫苗
•     2.5 动态光散射分析佐剂修饰后的CFP10-TB10.4融合蛋白水化半径
•     2.6 圆二色光谱检测佐剂对CFP10-TB10.4融合蛋白二级结构的影响
•     2.7 内源荧光光谱检测佐剂对CFP10-TB10.4融合蛋白三级级结构的影响
•   3 讨论
•   4 本章小结
• 第三章 菊糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗免疫原性及药代动力学研究
•   1 材料与方法
•     1.1 主要试剂和仪器
•     1.2 仪器与设备
•     1.3 试验方法
•   2 结果与分析
•     2.1 佐剂对CFP10-TB10.4 特异性抗体IgG滴度的影响
•     2.2 佐剂特异性IgG抗体滴度测定
•     2.3 血清中抗体的CFP10-TB10.4融合蛋白特异性检测
•     2.4 佐剂对脾淋巴细胞增殖水平的影响
•     2.5 佐剂对小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子水平的影响
•     2.6 佐剂对抗原在小鼠体内代谢动力学的影响
•     2.7 CT 样品药代动力学分析
•   3 讨论
•     3.1 结核分枝杆菌感染的免疫应答特征
• 197协同使用对CFP10-TB10.4 蛋白免疫原性的影响'>    3.2 菊糖与CRM₁₉₇协同使用对CFP10-TB10.4 蛋白免疫原性的影响
•     3.3 佐剂的免疫原性及安全性
•     3.4 菊糖协同CRM197作为佐剂的作用机制
•   4 本章小结
• 第四章 菊糖修饰的寨卡病毒E蛋白亚单位疫苗的制备
•   1 材料与方法
•     1.1 主要试剂、质粒和仪器
•     1.2 仪器与设备
•     1.3 试验方法
•   2 结果与分析
•     2.1 E蛋白的表达,纯化和表征
•     2.2 寨卡E蛋白亚单位疫苗的纯化
•     2.3 圆二色光谱检测佐剂对E蛋白二级结构的影响
•     2.4 内源荧光光谱检测佐剂对E蛋白二级结构的影响
•     2.5 佐剂修饰后的寨卡E蛋白分子排阻色谱分析
•     2.6 动态光散射检测佐剂对的寨卡E蛋白分子半径的影响
•   3 讨论
•   4 本章小结
• 第五章 菊糖修饰的ZIKV亚单位疫苗免疫原性及佐剂作用机制研究
•   1 材料与方法
•     1.1 材料与试剂
•     1.2 仪器与设备
•     1.3 试验方法
•   2 试验结果
•     2.1 佐剂对小鼠IgG抗体滴度的影响
•     2.2 抗菊糖佐剂特异性抗体的检测
•     2.3 佐剂对小鼠脾淋巴细胞的转化率的影响
• +T和 CD8⁺T亚群分布'>    2.4 流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD4⁺T和 CD8⁺T亚群分布
•     2.5 流式细胞术检测脾淋巴细胞的胞内细胞因子
•     2.6 菊糖佐剂修饰对抗原提呈细胞摄取抗原E蛋白的影响
•     2.7 菊糖修饰的E亚单位疫苗安全性初步研究
•   3 讨论
•     3.1 ZIKV引起的免疫应答特征
•     3.2 菊糖和洛索立宾对E蛋白免疫原性的影响
•     3.3 菊糖和洛索立宾协同作用的机制
•   4 本章小结
• 全文总结
• 论文创新点
• 展望
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 胡瞬

导师: 易有金,胡涛

关键词: 菊糖,佐剂,蛋白亚单位疫苗,结核分枝杆菌,寨卡病毒

来源: 湖南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 湖南农业大学

分类号: R392-33

DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000467

总页数: 128

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