枯草芽孢杆菌HH2对大熊猫离体粪便菌群及犬肠道菌群多样性的研究

论文摘要

大熊猫源枯草芽孢杆菌HH2（B.subtilis HH2）是本实验室从大熊猫粪便中分离并鉴定的一株能够分泌多种抗菌物质的细菌。它在不同碳源下能调控自身的分解能力、减少非必须能量的消耗;在恶劣环境中能形成芽孢,对温度和酸度有极强的耐受力并表现出良好抗逆性等。为了研究大熊猫源B.subtilis HH2未来能否作为大熊猫的益生菌进行人工饲喂和添加,本论文进行了以下两个试验:1.观察枯草芽孢杆菌B.subtilis HH2对亚成体大熊猫离体粪便菌群的影响:本试验选取8只亚成体大熊猫新鲜粪便,均等混合制备为大熊猫粪便培养基,分为两组,实验组加入5.0×108 cfu mL-1B.subtilis HH2菌液1 mL,对照组加入等体积PBS液,37℃恒温摇床于0h、24h、48h、72h培养后分别取培养基悬液作为样本,进行DNA提取、PCR扩增,使用16S rRNA进行高通量测序分析。结果显示大熊猫粪便培养至24h,实验组粪便微生态群落多样性升高,其余时段无明显变化;物种丰度分析表明:实验组在24h时,门分类水平,厚壁菌门、变形菌门呈增加趋势;纲分类水平中,γ-变形菌、梭菌纲呈增加趋势;目分类水平中肠杆菌目、假单胞菌目、气单胞菌目呈增加趋势;科分类水平中,肠杆菌、气单胞菌呈增加趋势;属分类水平中,实验组气单胞菌属、假单胞菌属和鞘氨醇杆菌属呈增加,B.subtilis HH2具有丰富优势菌群一过性作用。2.为探究大熊猫源B.subtilis HH2分离株对亲缘动物犬肠道菌群的影响,选择3-4月龄比格犬11只,随机分为两组（实验组:6只,对照组:5只）,在饲喂基础日粮后,每天对实验组犬灌服5.0×108 cfu mL-1B.subtilis HH2菌液10 mL、对照组灌服等体积生理盐水至14d后,在15d时对所有犬只灌服等体积2.0×109 cfu mL-1大肠杆菌菌液进行攻毒,于攻毒后0h、24h、48h、72h采集肛门拭子,肛门拭子进行DNA提取、PCR扩增,使用16S rRNA进行高通量测序分析。高通量分析表明攻毒后24h,实验组中肠道群落多样性增加,其他时段变化趋于平缓。实验组24h物种丰度分析中发现,门水平,厚壁菌门,变形菌门和拟杆菌门为优势物种;纲水平,变形菌和拟杆菌相对丰度占主导,优势菌群趋于丰富;目水平,对照组中气单胞菌,肠杆菌的相对丰度更高。48h时段,实验组拟杆菌纲、梭菌纲丰度高于对照组,而弯曲菌目、气单胞菌目丰度低于对照组。基于科水平,攻毒后,螺杆菌科实验组高于对照组,消化链球菌科实验组低于对照组;基于属水平,螺杆菌属、乳杆菌高于对照组,消化链球菌属实验组低于对照组。实验组致病菌群呈降低趋势。综上所述,初步探究发现B.subtilis HH2有效丰富亚成体大熊猫离体粪便及犬肠道的共同优势菌群（厚壁菌门、变形菌门）多样性,降低部分条件致病菌繁殖,即为大熊猫源B.subtilis HH2预防肠道疾病、提高健康水平以及发展大熊猫微生态制剂奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 大熊猫肠道菌群研究进展
•     1.1.1 大熊猫肠道菌群结构的研究背景
•     1.1.2 大熊猫肠道菌群的高通量测序研究
•     1.1.3 大熊猫源肠道益生菌和微生态制剂的研究
•   1.2 犬肠道菌群研究进展
•     1.2.1 犬肠道菌群结构研究背景
•     1.2.2 犬肠道菌群的高通量测序研究
•     1.2.3 犬肠道益生菌和微生态制剂的研究
•   1.3 枯草芽孢杆菌的相关研究
•     1.3.1 枯草芽孢杆菌的生物防治作用
•     1.3.2 枯草芽孢杆菌对肠道致病菌的拮抗作用
•   1.4 产肠毒素大肠杆菌（ETEC）
•   1.5 肠道微生物16S rRNA技术
•   1.6 研究目的与意义
• 第二章 添加B.subtilis HH2 对亚成体大熊猫离体粪便菌群的影响
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 粪样采集
•     2.1.3 培养基
•     2.1.4 主要仪器
•     2.1.5 主要试剂
•   2.2 方法
•     2.2.1 细菌的复苏与扩大培养
•     2.2.2 固定菌悬液浓度-平板计数法
•     2.2.3 大熊猫粪便培养基的配置
•     2.2.4 试验流程
•     2.2.5 样品处理
•       2.2.5.1 粪便样品DNA提取
•       2.2.5.2 PCR扩增
•       2.2.5.3 文库构建和上机测序
•       2.2.5.4 数据分析
•     2.2.6 统计分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 粪便培养基OD值测定
•     2.3.2 粪便基因组DNA的提取与PCR扩增
•     2.3.3 大熊猫离体粪便菌群多样性
•       2.3.3.1 数据分析
•       2.3.3.2 稀释性曲线
•       2.3.3.3 群落结构分析
•       2.3.3.4 多样性指数
•       2.3.3.5 PCA分析
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 B.subtilis HH2 对犬肠道菌群多样性的影响
•   3.1 材料
•     3.1.1 菌株
•     3.1.2 试验动物
•     3.1.3 培养基
•     3.1.4 主要仪器
•     3.1.5 主要试剂
•   3.2 方法
•     3.2.1 细菌的复苏与扩大培养
•     3.2.2 试验动物采样
•       3.2.2.1 试验动物的饲养管理
•       3.2.2.2 试验设计
•       3.2.2.3 样品采集
•     3.2.3 样品处理
•       3.2.3.1 粪便样品DNA提取
•       3.2.3.2 PCR扩增
•       3.2.3.3 文库构建和上机测序
•       3.2.3.4 数据分析
•     3.2.4 统计分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 粪便基因组DNA的提取与PCR扩增
•     3.3.2 犬粪便菌群多样性
•       3.3.2.1 数据分析
•       3.3.3.2 稀释性曲线
•       3.3.2.3 群落结构分析
•       3.3.2.4 多样性指数
•       3.3.2.5 PCA分析
•   3.4 讨论
•     3.4.1 菌液浓度的设计
•     3.4.2 肠道菌群分析
•   3.5 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张心悦

导师: 彭广能

关键词: 枯草芽孢杆菌,肠道菌群,大熊猫离体粪便

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

基金: “成都大熊猫繁育研究基金会项目”(CPF2015-09,CPF2015-04,CPF2017-05)

分类号: S852.61

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000820

总页数: 62

文件大小: 1790k

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