导读:本文包含了伯氏疟原虫论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:疟原虫,转染,甲醚,罗素,苏氨酸,磷酸酶,复方。
伯氏疟原虫论文文献综述
陈冰霞,张杰森,张梦欣,韩孟伊,李勇森[1]（2019）在《伯氏疟原虫感染小鼠脾脏T淋巴细胞及其表面分子的检测》一文中研究指出目的探讨感染伯氏疟原虫的C57BL/6小鼠脾脏不同免疫细胞的含量及表面分子变化。方法将C57BL/6小鼠尾静脉注射伯氏疟原虫进行感染,6 d后分离感染组和正常对照组小鼠的脾脏,制备单细胞悬液,然后通过流式细胞术检测小鼠CD8+T细胞、γδT细胞和T细胞的含量及其表面分子CXCR3、CD69、CD62L的表达水平变化情况。结果感染伯氏疟原虫的小鼠脾脏CD8+T细胞(5.51%±0.76%)、γδT细胞(0.31%±0.03%)和T细胞(18.60%±3.37%)的百分比含量较正常组(14.04%±1.31%、0.75%±0.07%、33.27%±3.76%)明显减低,差异有统计学意义(P<0.01);与正常组(21.45%±0.10%、33.49%±3.17%、16.72%±2.16%)相比,感染组小鼠脾脏CD8+T细胞、γδT细胞和T细胞的CXCR3(6.30%±0.15%、18.34%±0.61%、5.25%±0.25%)均明显下调(P<0.05);感染组小鼠脾脏CD8+T细胞、γδT细胞和T细胞的CD62L(67.98%±1.18%、54.37%±0.98%、55.06%±1.53%)较正常组(91.96%±0.75%、71.38%±1.02%、82.10%±1.04)%)均明显下调(P<0.05),而感染组小鼠脾脏CD8+T细胞、γδT细胞和T细胞的CD69(28.13%±0.37%、42.58%±2.06%、34.65%±0.43%)表达水平比正常组(3.70%±0.62%、11.59%±0.41%、7.69%±1.56%)高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论感染伯氏疟原虫的C57BL/6小鼠脾脏CD8+T细胞、γδT细胞和T细胞及其表达的CXCR3和CD62L均明显下调,而CD69的表达水平升高,提示机体感染疟原虫后,小鼠的T淋巴系细胞增殖不明显,但其迁移情况有所不同,存在一定的复杂性。(本文来源于《中国热带医学》期刊2019年10期）
郑文琪,王俊瑞,王华,刘飞,罗恩杰[2]（2019）在《伯氏疟原虫推测分泌动合子蛋白7截短片段传播阻断功能的研究》一文中研究指出目的通过体外阻断实验与蚊虫直接喂养实验对截短的重组伯氏疟原虫推测分泌动合子蛋白7(r Pb PSOP7) 31～210氨基酸(aa)片段的传播阻断能力进行研究。方法体外阻断实验,雌性BALB/c小鼠经腹腔注射5×10~6伯氏疟原虫感染红细胞(Pb RBC),感染后第3天,尾静脉收集血液,与r Pb PSOP7免疫小鼠血清(大肠埃希菌表达并纯化,与弗氏佐剂混合后免疫BALB/c小鼠)进行混合培养,观察不同稀释倍数(1∶5、 1∶10、1∶50)免疫血清培养15 min后疟原虫配子体出丝数及培养24 h后动合子形成数的变化,以同样稀释倍数的His标签蛋白免疫血清为对照。蚊虫直接喂养实验,r Pb PSOP7 (实验组)或His标签蛋白(对照组)与弗氏佐剂混合后各免疫5只雌性BALB/c小鼠,于末次免疫后第10天,用苯肼处理并经腹腔注射5×10~6Pb RBC,感染后第3天,每组小鼠用至少50只雌性按蚊直接吸食小鼠血液,吸血后第10天解剖按蚊,计数蚊胃壁上的囊合子数,计算蚊虫感染率。实验重复3次。结果体外阻断实验中,与His标签蛋白免疫血清对照组相比,r Pb PSOP7免疫血清1∶5、 1∶10和1∶50稀释培养的配子体出丝数分别减少了22.0%、 8.0%和2.0%,差异无统计学意义(P> 0.05);与对照组相比,培养24 h后,1∶5、 1∶10与1∶50稀释培养的动合子形成数分别减少了69.2%、 56.4%和48.6%(P <0.01),呈抗体剂量依赖关系。3次独立的蚊虫直接喂养实验结果显示,实验组每只蚊胃壁上的平均囊合子数分别为(31.1±34.9)、(30.2±32.3)和(29.1±35.1)个,较对照组的(87.1±69.3)、(96.4±82.9)和(85.3±69.1)个分别减少了64.2%、 68.6%和65.8%(P <0.01)。按蚊感染率由对照组的96.4%(27/28)、 89.3%(25/28)和89.3%(25/28),降至实验组的78.6%(22/28)、 78.6%(22/28)和75%(21/28),分别降低了17.8%、 10.7%与14.3%(P>0.05)。结论 r Pb PSOP7免疫血清可明显减少动合子及囊合子的形成,抗r Pb PSOP7血清具有一定的传播阻断能力。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2019年05期）
杜靖[3]（2019）在《基于CRISPR/CAS9系统的伯氏疟原虫基因组修饰技术的研究》一文中研究指出一、研究背景疟疾是一种通过蚊虫叮咬传染,将疟原虫带到血液中,短时期内引起周期性规律发作的全身发冷、发热、多汗,长期多次发作后,引起贫血和脾肿大等症状的虫媒传染病,目前仍然是全球最重要的传染病之一。根据世卫组织2018年12月公布的最新估算数据,2017年全球有2.19亿起疟疾病例,共有43.5万人因疟疾感染死亡。尤其对于5岁以下儿童,疟疾仍是他们宝贵生命的巨大威胁,平均每两分钟就有一名儿童死于疟疾。基因修饰技术在疟原虫生物学研究中具有重要作用,如疟原虫基因功能研究,特别是由于疟原虫感染的种属特异性,人类疟原虫不能感染模型动物,故在抗疟药、疟疾疫苗及抗药性的研究需要以动物疟原虫感染实验动物建立模型进行体内研究。虽然通常使用的啮齿类动物疟原虫与人类疟原虫如恶性疟原虫在生物学与药物敏感性等方面都有着高度的相似性,但两者的基因组编码的同一基因在序列上并不完全相同,且人类疟原虫表达的某些基因在啮齿类动物疟原虫基因组中并不存在,这使得以啮齿类动物疟原虫为模型进行药物、抑制剂或者疫苗研究时得出的结果并不可靠。所以利用基因组修饰技术将人类疟原虫基因转入到啮齿类动物疟原虫基因组构建动物模型对于疟原虫研究具有重大价值。由于疟原虫寄生于红细胞内,含有外源基因的载体需要穿过4层膜结构(宿主红细胞,原虫细胞膜,原虫胞质膜,原虫细胞核膜)才能抵达疟原虫细胞核内进行重组,这使得疟原虫的转染效率远远低于哺乳动物细胞;另外由于其寄生的生活方式,疟原虫基因组中缺失了约6500个编码基因,真核细胞内许多酶的缺失使得诸如RNA干扰(RNAi)技术等在哺乳动物细胞中常应用广泛的基因修饰技术无法应用于疟原虫。因此,转基因疟原虫的构建需要长时间的药物筛选和虫株克隆,耗时耗力且效率低下,严重阻碍了疟原虫基因功能研究的发展。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)序列和Cas(CRISPR-associated)蛋白系统是很多细菌和大部分古生菌的天然获得性免疫系统,以防止病毒和质粒入侵。CRISPR/CAS9系统已经被开发成为一项简便高效的基因编辑工具,广泛应用于各类物种的基因编辑研究。该系统主要包括两个元件:单链引导RNA(sgRNA)和Cas9核酸酶,共同诱导基因组上特定位点的DNA双链断裂。CRISPR/CAS9系统引导的靶向NDA双链断裂后可以通过激活非同源末端连接(nonhomologous endjoining,NHEJ)进行修复或在提供模板的条件下进行同源重组修复。CRISPR/CAS9系统已经被证实在生物体基因中进行基因敲除,基因敲入等的效率明显高于其他基因技术。此前已有将CRISPR/CAS9系统应用于恶性疟原虫、约氏疟原虫等物种进行基因编辑的研究。二、研究目的本研究拟基于CRISPR/CAS9系统基因编辑技术设计并构建双质粒系统以建立基于CRISPR/CAS9系统的伯氏疟原虫基因组修饰技术平台,同时对伯氏疟原虫的电转染方案进行选择和优化,筛选出较好的伯氏疟原虫电转染方案,然后应用双质粒伯氏疟原虫基因组修饰技术平台来构建含红色荧光蛋白的转基因伯氏疟原虫,验证基因组修饰技术平台的效率和可靠性,为将来的抗疟药物筛选、疫苗研发以及疟原虫基因功能等研究提供更可靠的转基因伯氏疟原虫和及其动物体内模型构建方案。叁、研究方法在本实验室已有的质粒pCMV/T7-NLS-T7pol、pT71.1-ccdB、PX459、PL0035、pmKate2-C的基础上,首先对伯氏疟原虫K173株在昆明小鼠体内培养、传代,提取伯氏疟原虫K173的全基因组DNA,然后利用分子生物学实验基本原理构建基于CRISPR/CAS9技术的双质粒系统,包括质粒pSGRNA-Cas9T2A-T7pol:含有以T7 Pol驱动伯氏疟原虫sgRNA表达,对疟原虫目的基因进行特定位点打靶;pDONOR:为靶向DNA双链断裂位点处同源修复提供模板,提供筛选阳性重组疟原虫的药物筛选基因(hDHFR-yFcu)。同时,利用构建的中间质粒PL0035-mKate2-3UTR,通过疟原虫的体外培养,裂殖体的纯化,流式细胞分析技术来进行伯氏疟原虫电转染效率的研究,优化得到较好的伯氏疟原虫电转染方案。最后,利用构建好的双质粒伯氏疟原虫基因组修饰平台改造的双质粒系统,针对伯氏疟原虫230p基因构建出可以替换疟原虫基因组中230p为红色荧光报告基因mKate2的双质粒,再运用疟原虫的体外培养,裂殖体纯化,乙胺嘧啶药物筛选等方法,来构建处转入红色荧光报告基因mKate2的转基因伯氏疟原虫并利用PCR扩增的方法进行鉴定验证。四、研究结果第一章的研究结果是打靶质粒pSGRNA-Cas9T2A-T7pol和模板质粒pDONOR的构建成功,经过PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,以及基因测序等实验验证基于CRISPR/CAS9系统设计的伯氏疟原虫双质粒基因编辑平台构建完成。第二章的研究结果是通过筛选和对于不同电转染方案转染伯氏疟原虫的转染效率对比,得到了较好的伯氏疟原虫电转染方案:使用LONZA的Lonza Nucleofector 4D核转染系统,在电转染程序FP167(电转试剂:P5 Primary Cell 4D X Kit)下,电转染量尽可能多的外源DNA,可以达到0.75%的转染效率。同时观察到电转染后的疟原虫生长发育情况正常,PCR鉴定转染结果可靠。第叁章的研究结果针对伯氏疟原虫230p基因替换为红色荧光报告基因mKate2的基因编辑目的,改造双质粒基因修饰平台得到质粒pSGRNA2464-Cas9T2A-T7pol和pDONOR-230p-3UTR-5UTR并通过基因测序验证。构建得到转入红色荧光报告基因mKate2的转基因伯氏疟原虫,并利用PCR扩增进行了鉴定验证。同时观察发现已加入sgRNA打靶序列的打靶质粒在转入伯氏疟原虫以后,双质粒系统发挥作用后会影响伯氏疟原虫的生长发育,寄生率增长减慢。五、研究结论成功构建基于CRISPR/CAS9系统的伯氏疟原虫基因组编辑平台,并探索优化得到目前较好的伯氏疟原虫电转染方案,构建得到替换230p基因为红色报告基因的转基因伯氏疟原虫,验证了基于CRISPR/CAS9系统的伯氏疟原虫基因组编辑平台对伯氏疟原虫进行基因组修饰的高效性和可靠性。六、意义与创新性本研究基于CRISPR/CAS9系统,针对伯氏疟原虫设计并构建了一个高效且易于操作的双质粒基因组修饰平台,并且对伯氏疟原虫电转染方案进行了优化得到了较好的、可靠的电转染方案,同时利用该双质粒基因组修饰平台构建了含有红色荧光报告基因mKate2的转基因伯氏疟原虫。本研究将构建转基因伯氏疟原虫的整个技术路线打通并针对关键步骤进行了优化,为后续转基因伯氏疟原虫的构建及其动物模型的建立奠定了基础,也为抗疟原虫药物、疫苗的筛选和疟原虫研究提供了可靠、高效的伯氏疟原虫基因组修饰技术方案和路线。(本文来源于《军事科学院》期刊2019-06-03）
吴一凡,吕芳丽[4]（2019）在《半乳糖凝集素-受体相互作用对感染伯氏疟原虫小鼠小肠病理的调节》一文中研究指出目的探讨半乳糖凝集素与其受体相互作用对伯氏疟原虫ANKA株感染小鼠小肠组织病理的调节。方法对昆明小鼠采用腹腔注射105个感染伯氏疟原虫的红细胞建立动物模型。对部分对照小鼠和感染伯氏疟原虫的小鼠经腹腔注射300 mmol/Lα-乳糖溶液,每日2次,达到竟争性封闭半乳糖凝集素的目的。采用H&E染色观察小鼠小肠组织病理变化,实时荧光定量PCR检测小肠M1型巨噬细胞极化标记物[诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和趋化因子受体2(CCR2)]以及M2型巨噬细胞极化标记物[几丁质酶3样蛋白1(YM1)和抵抗素样分子α(Fizz1)]的mRNA表达水平。采用SPSS 19.0对数据进行Student t检验分析。结果在感染后第8天,伯氏疟原虫单感染组小鼠和伯氏疟原虫感染+α-乳糖组小鼠小肠组织均出现明显病理损伤,小肠组织中M1型巨噬细胞极化标记物iNOS的mRNA表达水平与正常对照组相比显着增加,差异有统计学意义(分别为P<0.05和P<0.01);单感染组和感染+α-乳糖组小鼠小肠组织中CCR2的mRNA表达水平与正常对照组相比也显着增加,差异有统计学意义(P<0.01)。与伯氏疟原虫单感染组小鼠感染后第8天相比,伯氏疟原虫感染+α-乳糖组小鼠小肠组织的病理损伤更加严重,小肠组织中iNOS和CCR2的mRNA表达水平均显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论阻断半乳糖凝集素-受体相互作用可能通过促进小肠组织巨噬细胞M1极化,加重伯氏疟原虫红细胞内期感染小鼠的小肠组织病理,提示半乳糖凝集素与其受体之间的相互作用对控制伯氏疟原虫感染引起的肠道病理损伤具有重要作用。(本文来源于《热带医学杂志》期刊2019年05期）
孙林,洪明阳,曹雅明,朱晓彤,崔立旺[5]（2019）在《伯氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶6抗血清对原虫有性阶段发育抑制作用的研究》一文中研究指出目的:探讨伯氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶6(PPP6)作为传播阻断疫苗候选抗原的可行性。方法:PCR扩增PPP6蛋白全长编码基因并克隆入p ET32a(+)载体。IPTG诱导PPP6重组蛋白的表达,纯化后皮下免疫小鼠,收集抗PPP6免疫血清。ELISA和Western blot检测抗PPP6免疫血清效价和特异性。实验观察免疫血清对配子体出丝、动合子和囊合子发育的影响。结果:成功诱导PPP6重组蛋白表达,抗PPP6免疫血清抗体效价为1∶3 200;与对照组相比,抗PPP6免疫血清可显着抑制配子体出丝(P<0. 000 1);动合子数目和动合子转化率分别显着降低65. 3%和42. 07%(P<0. 000 1);抗PPP6血清1∶5倍稀释时,囊合子形成数量减少68. 91%(P<0. 000 1)。结论:PPP6蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。抗PPP6免疫血清具有明显的传播阻断效果。(本文来源于《中国免疫学杂志》期刊2019年10期）
孙林,洪明阳,曹雅明,朱晓彤[6]（2019）在《伯氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶5抗血清对有性阶段生长抑制作用的研究》一文中研究指出目的:探讨伯氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶5(PP5)作为传播阻断疫苗候选抗原的可行性。方法:PCR扩增PP5的功能区(407-711 aa),克隆入p ET32a(+)载体。IPTG诱导PP5重组蛋白表达后,纯化重组蛋白并免疫小鼠。ELISA方法检测抗PP5免疫血清效价。实验观察免疫血清对配子体出丝、动合子转化率和蚊胃内卵囊形成的影响。结果:成功表达PP5重组蛋白,抗PP5免疫血清抗体滴度可达1∶256 000,且对配子体出丝的抑制呈剂量依赖性,在1∶5和1∶10倍稀释时,配子体出丝数目分别减少75%和45%,与对照组相比差异具有显着统计学意义0. 05)。免疫血清可显着抑制动合子形成数目,在1∶5倍稀释时,动合子转化率减少14. 79%(P<0. 05),蚊感染率和胃内卵囊密度分别减少26. 05%和74. 19%(P<0. 05)。结论:PP5蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。抗PP5免疫血清具有明显的传播阻断效果。(本文来源于《中国免疫学杂志》期刊2019年08期）
杜靖,贝祝春,王红,徐力昆,王保刚[7]（2018）在《伯氏疟原虫电穿孔转染方案的优化》一文中研究指出目的通过在不同电转染方案下对电转染外源DNA到伯氏疟原虫效率进行对比,筛选优化出最佳的电转染方案。方法以mKate2为报告基因构建环状质粒p L0035-mKate2-3UTR,饲养昆明小鼠在体培养伯氏疟原虫(Plasmodium berghei),达到相应寄生率后体外同步化培养疟原虫,Nycodenz梯度离心纯化疟原虫成熟裂殖体,利用Lonza公司Nucleofector核转染系统对伯氏疟原虫进行电转染,采用流式细胞仪分析电转染效率,并提取昆明小鼠全血DNA作为模板进行PCR扩增,鉴定转染结果。结果经转染后流式细胞仪分析和血涂片吉姆萨染色镜下观察,Lonza Nucleofector 4D核转染系统电转染程序FI115与FP167均可使转染效率达到10~(-3),FP167下转染10μg环状质粒效率接近10~(-2)。在相同电转染条件下,外源DNA越多,转染效率越高。结论优化得到伯氏疟原虫电转染较好方案,为后续疟原虫药物、疫苗及生物学相关研究提供了可靠、高效的转染方案。(本文来源于《军事医学》期刊2018年12期）
徐诚,代勇,孙红霞,杨叶鹏[8]（2018）在《暗罗素及其联合传统抗疟药治疗伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟的相关研究》一文中研究指出目的研究暗罗素和传统抗疟药物联合使用对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟的疗效差异。方法 SPF级昆明小鼠腹腔接种伯氏疟原虫氯喹抗性株以及伯氏疟原虫常规株分别建立伯氏疟原虫氯喹抗性模型以及常规模型,按照"4D实验法"接种2 h后连续口服给药4天。设置复方蒿甲醚、蒿甲醚、本芴醇分别与暗罗素等效剂量组配伍,另设置各单组分别考察其等效剂量下对伯氏疟原虫常规鼠疟以及氯喹抗性鼠疟的作用。取血观察并计算镜检后24 h原虫血症密度、转阴率、复燃率及28天治愈率。结果标准剂量下暗罗素、复方蒿甲醚、蒿甲醚、本芴醇单独治疗伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟后,均使疟原虫受到不同程度抑制,用药24 h后各给药组原虫血症有不同程度降低,28天治愈率分别为70%、100%、10%及60%,而空白模型组原虫血症密度在没有药物干预的情况下上升;标准剂量下暗罗素分别配合复方蒿甲醚、蒿甲醚、本芴醇治疗伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟后,各组24 h原虫血症密度均小于各单品单独使用(P <0. 05),除复方蒿甲醚组外,其余各组联合暗罗素使用后,28天治愈率均有所提升,复燃率降低,其中暗罗素联合复方蒿甲醚效果最佳,镜检观察24 h原虫血症密度为各组最低值(6. 02±0. 74)%(P <0. 05)。结论标准剂量下暗罗素、复方蒿甲醚、蒿甲醚以及本芴醇对氯喹抗性鼠疟均有直接抑制作用,标准剂量暗罗素分别联合复方蒿甲醚、蒿甲醚及本芴醇,均能增强单品药物对氯喹抗性鼠疟的治疗作用,可以说明复方蒿甲醚、本芴醇、蒿甲醚配合暗罗素后有一定的协同作用,能提高对氯喹抗性鼠疟的治疗效果。(本文来源于《时珍国医国药》期刊2018年11期）
崔爱[9]（2018）在《疟原虫新型分子-TIP在伯氏疟原虫各期的表达定位及对鼠脑型疟疾的免疫作用》一文中研究指出目的:疟疾,由疟原虫经媒介按蚊叮咬传播引起的一种全球性、严重威胁人类健康的寄生虫类疾病。世界卫生组织将其与结核病、艾滋病并称为二十一世纪全球叁大首要人类公共卫生问题。在全球性疾病的比例中疟疾占有很大的比重负担,目前约有2亿疟疾病例,每年约43万人死于疟疾。尽管过去15年里医学研究在消灭疟疾方面取得了相当大的进展,但是伴随着按蚊对杀虫剂抗药性的增强、疟原虫对常用抗疟药物青蒿素、氯喹等耐药性的产生以及现阶段仍缺乏高效的抗疟疫苗,使得疟疾的治疗与防控仍是目前人类面临的一项艰巨任务。脑型疟疾(cerebral malaria,CM):凶险型疟疾临床类型的一种,最为常见,病情亦最为严重。其主要由恶行疟原虫感染所致,且为5岁以下的儿童感染疟疾的主要死因。学者们普遍认为脑疟的发生主要与患者机体内过度的炎症免疫反应相关。过度产生的炎性因子促使内皮细胞黏附分子如:CD36、CSA和ICAM-1等表达水平上调,增加了疟原虫感染的红细胞(pRBC)、血小板和淋巴细胞在微循环内的聚集,进而堵塞微循环,刺激了血管内皮细胞产生过多内皮素-1等其他物质,进而造成了脑血管收缩、脑组织乏氧。组织病理学亦证实,脑疟发生的病理基础是pRBC黏附于血管内皮细胞,滞留在深部脑血管内,引起微循环障碍。引起脑疟死亡的机制目前尚不十分清楚,有很多对脑疟发生发展的假说,但是仍无确切定论。目前CM的致死率高达10~20%,导致死亡的人数占疟疾总人数的80%,即使有幸存活下来,仍有10%~20%的幸存者留有神经系统类的后遗症。因此,更好地研究并阐明CM的发生机制,制定有效合理的预防与治疗策略是亟待解决的重要问题。关于疟疾发生过程中疟原虫对宿主作用的研究近年来有了一些新的发现。曾有研究表明,疟原虫表达或分泌的某种蛋白能够参与调节宿主的免疫应答。Fiscella等研究者发现在哺乳动物体内存在一种T细胞免疫调节蛋白(T cell immunomodulatory protein,TIP)。他们的研究证实,在宿主抗急性移植免疫模型的鼠体内,TIP能够明显抑制移植物引起的免疫排斥反应,具有类似保护作用。Nono等人研究发现在多房棘球绦虫早期的棘球蚴体内存在一种TIP同系物-EmTIP蛋白,EmTIP能够分泌到早期棘球蚴体外,参与调节宿主Th1型免疫效应。Kaczanowski等通过生物信息学方法分析比对发现,在疟原虫的基因组中存在一个与哺乳类体内TIP具有同源性较高的蛋白同系物,将其注明为假设蛋白“Q813H7”。疟原虫TIP同系物(PbTIP)在疟原虫体内的存在及其作用、功能目前尚未见报道,因此PbTIP的定位与相关研究成为了我们关注的焦点。为此,我们对疟原虫TIP的分布、定位以及能否如同哺乳类动物体内存在TIP具有的功能相同或相似而在脑疟的发生发展过程中发挥类似的免疫保护性调节作用成为我们研究的重点,旨在为CM病理损伤提供有效防治的依据,进而针对脑疟制定出更加有效的治疗策略。研究方法:1、应用生物信息学对PbTIP进行分析。Plasmodium berghei TIP(PbTIP)基因筛选于疟原虫数据库PlasmoDB。应用SMART预测分析PbTIP蛋白特性。BLAST与ClustalW进行疟原虫种属同源性alignment分析。2、P.berghei ANKA裂殖体/配子体/动合子培养与分离。裂殖体:小鼠腹腔注射pRBC,感染率达5%~10%左右,心脏采血与裂殖体培养基混匀培养,55%Nycodenz分离液梯度密度分离。配子体:小鼠腹腔注射pRBC,小鼠感染的第4天给予小鼠饮用磺胺嘧啶饮用水,待第6天心脏采血置于48%(v/v)Nycodenz分离液中进行梯度密度分离。动合子:小鼠腹腔注射pRBC,感染第3天,心脏采血混合于动合子培养液中。62%Nycodenz分离液梯度密度分离。3、PbTIP---mRNA表达阶段的初步检测。pRBC腹腔感染BALB/c小鼠,饥饿饲养的雌性按蚊吸食鼠血液,第15、21天提取按蚊中肠(卵囊阶段)与唾液腺(子孢子阶段)保存于Trizol中。取24h和48h疟原虫感染的小鼠肝组织,保存于Trizol中。P.berghei ANKA培养与分离的裂殖体、配子体、动合子亦保存于Trizol中。Trizol法提取各样品RNA。应用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser二步法反转录试剂盒获得各样品cDNA,特异性引物RT-PCR法检测各阶段PbTIP的表达情况。4、PbTIP HA-tag型疟原虫的克隆与鉴定。依据PlasmoGEM提供的实验流程将线性化的PbTIP HA-tag进行电转,与成熟裂殖体进行基因同源重组。基因组整合了hDHFR作为药物压力选择基因,经乙胺嘧啶药物筛选获取带有hDHFR耐药型的疟原虫。PCR方法对耐药型疟原虫进行鉴定。5、PbTIP基因片段(rPbTIP)扩增与pET32a-rPbTIP表达载体的构建。小鼠腹腔注射pRBC,感染率达30%左右,提取疟原虫全虫DNA。以DNA为模板,特异性引物扩增目的片段基因,T4连接酶与经双酶切消化过的原核表达载体pET32a(+)进行连接反应,连接后的载体转入到宿主菌E.coil BL-21进行片段蛋白表达。6、rPbTIP片段蛋白表达与纯化。菌落置于LB液体培养基中,菌液OD值达到0.4-0.6时加入终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导。诱导上清液过滤后经镍氨叁乙酸琼脂糖树脂进行蛋白纯化。纯化且浓缩后的目的蛋白rPbTIP经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。7、小鼠多克隆抗血清的制备。BALA/c小鼠随机分为2组。实验组为重组片段蛋白rPbTIP免疫组,对照组为PBS组。纯化浓缩后的rPbTIP与完全弗氏佐剂混合,皮下多点注射免疫小鼠。再于第3周,第5周与不完全弗氏佐剂混合,分别给予两次加强免疫。ELISA检测多克隆免疫血清抗体滴度。8、rPbTIP免疫抗血清对分离提取的P.berghei ANKA裂殖体/配子体/动合子各期核蛋白、胞浆蛋白与膜蛋白进行Wertern Blot检测。小鼠腹腔注射pRBC,感染率约30%左右,心脏采血。血细胞置于0.17M NH4Cl中冰上裂解红细胞,Nycodenz分离液对各期虫体进行梯度密度分离,分离纯化所得各期虫体按照Invent Biotechologies蛋白分离提取试剂盒指导步骤提取各期不同组份蛋白进行Wertern Blot检测。9、应用IFA法,利用所获得rPbTIP免疫抗血清对PbTIP进行表达定位。提取血液中各阶段疟原虫,4%多聚甲醛固定。一抗为稀释后的抗rPbTIP免疫血清进行孵育,二抗加入FITC标记的山羊抗鼠IgG,DAPI核染色,OLYMPUS BX53显微镜成像仪观察,Adobe Photoshop处理图片。10、PbTIP基因敲除型伯氏疟原虫株的构建与鉴定。应用双交叉同源基因重组技术构建目的基因敲除型疟原虫株。利用hdhfr表达结构替换敲除PbTIP目的基因序列。以P.berghei基因组DNA为模板,PCR方法分别扩增3UTR和5UTR。△PbTIP打靶载体完全线性化后进行电转染,经乙胺嘧啶药物筛选获取带有hDHFR敲除型疟原虫,外周血提取基因进行△PbTIP鉴定。11、鼠脑疟模型的建立与实验分组。除正常对照组外,C57BL/6小鼠经腹腔感染pRBC后随机分为二组:一组为野生PbA感染+PBS尾静脉注射处理组(PBS组),另一组为野生PbA感染+rPbTIP尾静脉注射处理组(rPbTIP组)。rPbTIP组每日1次,分别于第0、1、3、5、7天每日小鼠尾静脉注射rPbTIP 2mg/kg。12、小鼠血脑屏障通透性(BBB)检测。感染的第6天小鼠出现呼吸浅、体弱无力、肢体瘫痪、步态不稳、阵发性颤抖等脑疟症状,每组随机选取小鼠给予尾静脉注射伊文思蓝染料。1h后麻醉小鼠,生理盐水心脏灌注后取出小鼠脑组织浸入到甲酰胺液体中,630nm分光光度计下检测上清液中Evens blus含量。13、免疫组化与HE染色。小鼠在感染第6天出现脑疟症状。每组随机选取小鼠,取脑组织进行组织学检查。脑组织切片用于苏木精-伊红(HE)染色及黏附因子ICAM-1、VCAM-1、CD36抗体组化染色。观察鼠脑疟模型中脑组织微血管阻塞与渗漏情况。14、RNA提取及real time-PCR方法对两组细胞因子水平的检测比较。感染第0、3、5、7天随机选取每组小鼠,无菌条件下取出小鼠脾脏与脑组织,传统Trizol法提取RNA。应用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser二步法反转录试剂盒获得各样品cDNA。上述cDNA为模板,各特异性引物进行real-time-PCR反应,比较PBS组与rPbTIP组脑组织内VCAM-1、ICAM-1和CD36与脾脏内CXCL9,CXCL10和CXCR3的RNA表达差异。15、脾细胞培养。在感染第0、3、5、7天随机取出每组小鼠,无菌条件下取出小鼠脾脏。筛网研磨小鼠脾组织制备细胞悬液获取脾细胞,终浓度调整为10~7/mL,于24孔细胞培养板中培养备用。16、ELISA法检测脾细胞培养上清与血清中细胞因子的表达水平。分别在感染第0、3、5、7天随机选取每组小鼠,无菌条件下心脏采血,离心取血清。R&D Systems ELISA试剂盒分别检测已收集的脾细胞上清培养液与血清中IFN-γ,TNF-α,IL-1,IL-12,IL-10和TGF-?细胞因子的表达水平。17、流式细胞检测。在感染的第0、3、5、7天,每组随机选取小鼠,无菌条件下取出小鼠脾脏,筛网研磨小鼠脾组织,悬浮脾细胞,计数细胞浓度,调整脾细胞终浓度为10~7/mL。待测细胞进行特异性抗体染色,每管流式管中加入4%多聚甲醛固定上机待测。18、统计方法。数据结果使用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,计算各组数据均值±标准误。组间组内差异采用独立样本t检验方法或单因素方差分析。各组生存差异性分析采用Kaplan-Meier long-rank检验方法,P<0.05具有统计学差异。研究结果:1、PbTIP生物信息学分析。依据疟原虫数据库PlasmoDB结果显示,疟原虫TIP(PbTIP),ID:PBANKA_124360,基因位于12号染色体上,由703个氨基酸编码蛋白,分子量大小80.4kDa,为一类保守型疟原虫蛋白,目前功能未知。应用生物信息学分析PbTIP在N端有一小段信号肽,并且分别在N,C两端均存在跨膜区。Pfam数据库分析可知,PbTIP属于蛋白质家族PF13517(家族:VCBS)。PbTIP 204-335aa片段结构域在其他物种中也存在。该区域约有100个残基,存在于多个弧菌、Colwellia、慢根瘤菌和Shewanella等其他几种细菌的蛋白中,综合其他物种蛋白大小、重复拷贝数,分布以及蛋白活性提示,PbTIP 204-335aa区域可能具有类似的某种粘附作用,生物信息学分析为后期PbTIP蛋白验证及片段筛选提供了依据。2、PbTIP—mRNA表达水平的检测。提取pRBCs感染小鼠24h、48h的肝组织,疟原虫裂殖体、配子体、动合子及第15天、21天从感染按蚊卵囊阶段与唾液腺子孢子阶段提取的RNA,反转录的cDNA经PbTIP特异性引物扩增。结果发现PbTIP在上述各阶段中mRNA均有表达,说明PbTIP即可以表达在宿主的红外期与红内期,也可表达在传播媒介按蚊体内。可见PbTIP能够存在于疟原虫的整个生活史。3、rPbTIP片段载体构建与片段蛋白表达纯化。成功扩增出rPbTIP片段基因,与Genebank中公布的序列进行比对结果相同。构建的pET32a(+)-rPbTIP载体经过BamHⅠ,XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖电泳鉴定,与预期一致,说明rPbTIP片段蛋白载体构建成功。含有pET32a(+)-rPbTIP载体的E.coil BL-21菌株来表达rPbTIP重组蛋白,蛋白经His-tag镍氨叁乙酸琼脂糖纯化,样品经SDS-PAGE电泳在35kDa位置处可见清晰的目的条带,蛋白纯度大于85%,浓度约1mg/mL。片段蛋白经SDS-PAGE电泳和抗His标签抗体Western blot检测,均在35kDa位置呈现清晰的免疫印迹条带,结果证实rPbTIP蛋白表达成功。4、rPbTIP多抗血清的获取与其特异性检测。重组蛋白rPbTIP免疫SPF级6-8周龄雌性BALB/c小鼠,获取多克隆免疫抗血清。ELISA结果显示,初次免疫后第2周小鼠体内血清特异性抗体有显着的升高。随后的两次加强免疫,抗体达到峰值且始终维持在较高水平上。5、Wertern Blot-PbTIP蛋白表达鉴定。获得的裂殖体、配子体、动合子各期核蛋白,胞浆蛋白与膜蛋白30μg/孔上样。rPbTIP多抗免疫血清为抗体与转有疟原虫各阶段不同组份蛋白的PVDF膜进行Wertern Blot反应,结果显示仅膜蛋白在80kDa处有清晰可见的免疫印迹条带。6、IFA-PbTIP检测。利用所获得的的rPbTIP免疫血清对野生疟原虫体内PbTIP不同阶段的疟原虫进行定位,经FITC荧光抗体标记,DAPI染核,结果可见各期疟原虫均在膜表面呈现绿色荧光,与Wertern Blot结果一致,说明PbTIP为伯氏疟原虫表达的一类特异性膜表面蛋白。7、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组中脑组织的免疫病理损伤减弱。实验研究比较了PBS,rPbTIP两组第6天小鼠脑组织的病理变化与粘附分子VCAM-1、ICAM-1和CD36表达水平的差异。与PBS组相比,rPbTIP组中作为血脑屏障渗漏的伊文思蓝染料指示剂渗出程度较低,完整脑组织颜色较浅,对照PBS组中脑组织则颜色较深,说明rPbTIP在保护了小鼠血脑屏障的完整性上能够发挥作用。同时可见rPbTIP组每个视野内白细胞沉积的血管数量明显低于PBS组,P<0.05。此外,rPbTIP组脑微血管内皮细胞上相应的粘附分子VCAM-1、ICAM-1和CD36免疫组化统计学分析结果可知,其表达量均降低,P<0.05。rPbTIP组内脑组织VCAM-1、ICAM-1和CD36与脾脏CXCL9,CXCL10和CXCR3的mRNA表达水平同样相应的减弱,P<0.05。8、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组内P.berghei感染C57BL/6小鼠的CM发生率降低。PBS组小鼠于第6~12天死亡,但rPbTIP处理组小鼠疟原虫血症水平相对较低,仅有不到30%的小鼠死于ECM,其余小鼠多死亡在感染后第12天且主要死于贫血。9、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组研究发现,T细胞介导促炎细胞因子释放减少。比较了PBS与rPbTIP两组中IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-12血清浓度,脾细胞培养上清浓度及脾组织中促炎细胞因子mRNA表达量的变化。与PBS组相比,rPbTIP组中IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-12细胞因子血清浓度、脾细胞培养上清浓度和mRNA表达水平均明显降低。10、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组中Tregs与抗炎症细胞因子IL-10/TGF-?的表达增多。与PBS组相比,rPbTIP组中血清和脾细胞培养上清中IL-10和TGF-?表达量增多。脾细胞流式术检测,rPbTIP组中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞绝对值和百分比明显高于PBS组。结论:1、PbTIP是伯氏疟原虫表达的一类特异性膜表面蛋白。2、鼠脑型疟疾模型rPbTIP组可见脑组织免疫病理损伤减少,血脑屏障完整性增强。3、鼠脑型疟疾模型经rPbTIP处理后缓解了ECM的高发生率。4、鼠脑型疟疾模型经rPbTIP处理后可见Th1细胞介导的过度免疫反应释放的促炎因子有所减少。5、鼠脑型疟疾模型经rPbTIP处理后可见Tregs与抗炎症细胞因子IL-10/TGF-?的表达水平提高。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-05-01）
杨叶鹏[10]（2018）在《暗罗素与青蒿素类药物联合使用对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效及相关免疫学机理研究》一文中研究指出目的:1、培育具有稳定抗性的伯氏疟原虫青蒿素抗性株,并建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,考察其抗性指数;2、在前期实验基础上,缩小暗罗素用药区间,探究暗罗素以何种剂量与复方蒿甲醚联合使用可达到较好的抗疟效果;3、考察暗罗素对小鼠血清Ig G含量和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响;从而探讨暗罗素抗疟的相关免疫学机理。方法:按逐量递增给药法,本实验继续培育伯氏疟原虫青蒿素抗性株至第62代,考察第60代虫株抗性指数。采血涂片镜检原虫感染率,测定抗性株ED50,计算第60代虫株的抗性指数。抗疟疗效试验采用28天治愈法,建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,末次给药24h后及第7天后每周采血镜检一次,计算各组小鼠原虫感染率、转阴率、复燃率及28天治愈率,考察不同剂量暗罗素、复方蒿甲醚、青蒿素以及不同剂量暗罗素与复方蒿甲醚联合使用对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效差异。采用ELISA法检测小鼠血清中Ig G的含量,再进行腹腔巨噬细胞吞噬功能试验;考察不同剂量暗罗素对小鼠血清中Ig G含量和腹腔巨噬细胞吞噬百分率的影响。结果:1、从伯氏疟原虫青蒿素抗性株第53代继续培育至第62代,计算得出第60代虫株抗性指数为15.78,与前期实验相比,抗性增长变缓。2、1.75倍、2倍及2.25倍暗罗素单独使用对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟有抑制作用,其中2.25倍暗罗素剂量组小鼠原虫转阴率达66.67%,但均出现复燃,达不到28天治愈。3、2.5倍复方蒿甲醚和3600.00mg/kg/d的青蒿素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟均有抑制作用,但其复燃率高,均无法达到28天治愈,虫株对复方蒿甲醚疑似耐药。4、与单独使用暗罗素、复方蒿甲醚比较,2倍、2.25倍暗罗素与2.5倍复方蒿甲醚联合使用对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟效果相对较好,部分小鼠可达到28天治愈。5、1.75倍、2倍及2.25倍暗罗素对正常小鼠血清中Ig G的含量和胸腺指数基本无影响,但小鼠的脾脏指数有轻微升高。6、伯氏疟原虫青蒿素抗性株感染的小鼠血清中Ig G的含量和脾脏指数升高,胸腺指数基本正常。1.75倍、2倍及2.25倍暗罗素对感染小鼠的胸腺指数基本无影响,但是对感染小鼠血清中Ig G的含量和脾脏指数有影响,2倍和2.25倍暗罗素剂量组小鼠血清中Ig G升高,2.25倍暗罗素剂量组小鼠的脾脏指数明显降低。7、1.75倍、2倍和2.25倍暗罗素可不同程度提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率,其中2.25倍暗罗素剂量组小鼠吞噬百分率最高。结论:建立了第60代伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,其抗性指数为15.75。2倍、2.25倍暗罗素与2.5倍复方蒿甲醚联合使用对青蒿素抗性鼠疟效果相对较好,部分小鼠可达到28天治愈。暗罗素可能会改善青蒿素抗性虫株感染小鼠的免疫功能。(本文来源于《成都中医药大学》期刊2018-05-01）
伯氏疟原虫论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的通过体外阻断实验与蚊虫直接喂养实验对截短的重组伯氏疟原虫推测分泌动合子蛋白7(r Pb PSOP7) 31～210氨基酸(aa)片段的传播阻断能力进行研究。方法体外阻断实验,雌性BALB/c小鼠经腹腔注射5×10~6伯氏疟原虫感染红细胞(Pb RBC),感染后第3天,尾静脉收集血液,与r Pb PSOP7免疫小鼠血清(大肠埃希菌表达并纯化,与弗氏佐剂混合后免疫BALB/c小鼠)进行混合培养,观察不同稀释倍数(1∶5、 1∶10、1∶50)免疫血清培养15 min后疟原虫配子体出丝数及培养24 h后动合子形成数的变化,以同样稀释倍数的His标签蛋白免疫血清为对照。蚊虫直接喂养实验,r Pb PSOP7 (实验组)或His标签蛋白(对照组)与弗氏佐剂混合后各免疫5只雌性BALB/c小鼠,于末次免疫后第10天,用苯肼处理并经腹腔注射5×10~6Pb RBC,感染后第3天,每组小鼠用至少50只雌性按蚊直接吸食小鼠血液,吸血后第10天解剖按蚊,计数蚊胃壁上的囊合子数,计算蚊虫感染率。实验重复3次。结果体外阻断实验中,与His标签蛋白免疫血清对照组相比,r Pb PSOP7免疫血清1∶5、 1∶10和1∶50稀释培养的配子体出丝数分别减少了22.0%、 8.0%和2.0%,差异无统计学意义(P> 0.05);与对照组相比,培养24 h后,1∶5、 1∶10与1∶50稀释培养的动合子形成数分别减少了69.2%、 56.4%和48.6%(P <0.01),呈抗体剂量依赖关系。3次独立的蚊虫直接喂养实验结果显示,实验组每只蚊胃壁上的平均囊合子数分别为(31.1±34.9)、(30.2±32.3)和(29.1±35.1)个,较对照组的(87.1±69.3)、(96.4±82.9)和(85.3±69.1)个分别减少了64.2%、 68.6%和65.8%(P <0.01)。按蚊感染率由对照组的96.4%(27/28)、 89.3%(25/28)和89.3%(25/28),降至实验组的78.6%(22/28)、 78.6%(22/28)和75%(21/28),分别降低了17.8%、 10.7%与14.3%(P>0.05)。结论 r Pb PSOP7免疫血清可明显减少动合子及囊合子的形成,抗r Pb PSOP7血清具有一定的传播阻断能力。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
伯氏疟原虫论文参考文献
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