猪病毒性腹泻六重RT-PCR检测方法的建立应用及猪流行性腹泻病毒的分离鉴定

论文摘要

病毒性腹泻严重损害了养猪业,在世界范围内造成了巨大的经济损失。引起腹泻的主要病毒有猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRV-A）,近年来,也发现了一些新出现的病毒,如猪库布病毒（PKV）、猪札幌病毒（PSaV）和猪丁型冠状病毒（PDCoV）。由于肠道病原体的多样性以及肠道病毒感染引起的临床症状和病理变化的高度相似性,对猪病毒性腹泻的鉴别诊断具有重要的意义。为建立一种快速检测和鉴别上述病毒的多重RT-PCR方法,我们针对TGEV、PEDV和PDCoV的N基因、PRV-A的VP7基因以及PKV和PSaV的多聚蛋白设计了特异性引物。成功地建立并优化了用于检测6种腹泻病毒多重RT-PCR技术,并且具有较高的敏感性和特异性。最后,采用多重RTPCR法对382份腹泻标本进行分析,结果表明,在2015年10月至2017年4月期间,PDCoV、PSaV和PEDV在中国养猪场主要流行,由两种或三种猪肠内病毒共同感染。多重RT-PCR方法特异性地针对在我国猪场流行的主要猪肠道病毒,为临床诊断实验室提供有价值的工具。之前结果表明PEDV在我国猪场主要流行,故取多重RT-PCR检测结果PEDV阳性cDNA再采用针对PEDV N基因扩增该基因片段的引物,并且成功扩增出该目的片段。从山东烟台某猪场的腹泻样本中检测获得了一株PEDV,并对该毒株进行全基因测序,分析该毒株与流行毒株的关系以及S基因的遗传进化关系。所有分析结果均表明:与经典毒株相比,本研究分离获得的PEDV毒株发生了较大变化为变异毒株。该结果警示我们,对当前流行的PED防控不能采用早年分离的毒株制作的疫苗,须以当下流行毒株为背景来研制新的PEDV疫苗。为建立PEDV血清学检测方法,制备针对PEDV-N蛋白的单克隆抗体,采用RT-PCR方法从PEDV YT1401株中扩增其N基因片段,构建原核表达重组质粒pET30a-PEDV-N,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞中并进行条件优化诱导表达、SDS-PAGE、Western Blotting试验。结果表明,SDS-PAGE检测获得了约57 kDa的表达产物,与目的蛋白大小符合;且具有良好的免疫学活性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 猪病毒性腹泻六重RT-PCR检测方法的建立和应用
•   1.1 文献综述
•     1.1.1 猪流行性腹泻病毒分子生物学特性
•     1.1.2 猪传染性胃肠炎病毒分子生物学特性
•     1.1.3 猪轮状病毒病毒分子生物学特性
•     1.1.4 猪丁型冠状病毒分子生物学特性
•     1.1.5 猪札幌病毒分子生物学特性
•     1.1.6 病毒检测技术
•   1.2 研究的目的与意义
•   1.3 实验材料
•     1.3.1 病毒
•     1.3.2 实验病料
•     1.3.3 病料的处理
•     1.3.4 引物设计与合成
•     1.3.5 主要试剂
•     1.3.6 主要仪器设备
•     1.3.7 分子生物学分析软件和网站
•   1.4 试验方法
•     1.4.1 病毒RNA抽提
•     1.4.2 cDNA合成
•     1.4.3 单项RT-PCR
•     1.4.4 单项RT-PCR引物浓度
•     1.4.5 单项RT-PCR灵敏性实验
•     1.4.6 多重RT-PCR的引物浓度的确定
•     1.4.7 多重RT-PCR的特异性实验
•     1.4.8 多重RT-PCR的敏感性实验
•     1.4.9 多重RT-PCR的重复性实验
•     1.4.10 多重RT-PCR的最终体系的确定
•     1.4.11 多重RT-PCR检测临床样品
•   1.5 结果
•     1.5.1 单项RT-PCR引物浓度的确定
•     1.5.2 单项RT-PCR敏感性实验
•     1.5.3 三重RT-PCR方法的扩增及优化
•     1.5.4 四重RT-PCR方法的扩增及优化
•     1.5.5 五重RT-PCR方法的扩增及优化
•     1.5.6 六重RT-PCR方法的扩增及优化
•     1.5.7 六重RT-PCR最终体系
•     1.5.8 多重RT-PCR敏感性
•     1.5.9 多重RT-PCR重复性
•     1.5.10 多重RT-PCR特异性
•     1.5.11 多重RT-PCR检测临床样品
•   1.6 讨论
• 第二章 猪流行性腹泻病毒YT1401株分离、鉴定及分子进化特征分析
•   2.1 研究目的及意义
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 病料
•     2.2.2 工具酶和主要试剂
•     2.2.3 引物设计
•     2.2.4 病毒RNA抽提
•     2.2.5 PEDV鉴定及全基因克隆
•     2.2.6 PEDV YT1401株全基因组及S基因序列分析
•   2.3 结果
•     2.3.1 分离病毒的PCR鉴定结果
•     2.3.2 PEDV YT1401全基因扩增基序列测定、拼接
•     2.3.3 PEDV YT1401株全基因组的遗传进化分析
•     2.3.4 PEDV YT1401株S基因遗传进化分析
•     2.3.5 PEDV YT1401株S蛋白分析
•   2.4 讨论
• 第三章 pET-30a与PEDV-N基因克隆构建、原核表达、纯化鉴定
•   3.1 研究的目的与意义
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 质粒与表达载体
•     3.2.2 实验菌株
•     3.2.3 主要酶与试剂
•     3.2.4 主要仪器设备
•     3.2.5 pET-30a载体制备
•     3.2.6 PEDV N基因外源片段制备
•     3.2.7 双酶切及纯化
•     3.2.8 重组质粒的构建
•     3.2.9 pET-N蛋白原核表达
•     3.2.10 SDS-PAGE分析
•     3.2.11 包涵体的纯化
•     3.2.12 Western Blotting分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 pET-30a质粒准确性验证
•     3.3.2 PEDV N基因全长的扩增
•     3.3.3 EcoR V和 BamH I双酶切N质粒
•     3.3.4 阳性重组质粒pET-N的鉴定
•     3.3.5 阳性重组质粒pET-N挑单克隆菌液PCR鉴定
•     3.3.6 37℃、25℃、18℃诱导结果
•     3.3.7 咪唑梯度洗脱蛋白鉴定结果
•     3.3.8 Western Blotting分析
•   3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 在学期间的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 丁光明

导师: 王建林,刘光亮

关键词: 多重,猪肠道病毒,病毒分离鉴定,进化分析,蛋白表达

来源: 兰州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 兰州大学

分类号: S852.651

总页数: 91

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