鸭星状病毒3型流行株分子特征及荧光定量检测方法的建立

论文摘要

鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）是一种对雏鸭造成急性、高度接触性的传染病,病原包括鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）和鸭星状病毒（Duck astrovirus,DAstV）。现有研究表明鸭群中存在4种鸭星状病毒（DAstV）,即鸭星状病毒1型（DAstV-1）、DAstV-2、DAstV-3和DAstV-4,其中DAstV-3是近年来在我国鸭群中新发现的感染率和发病率均较高的星状病毒,流行的地区越来越广。目前关于DAstV-3的基因组分子特征及其快速检测方法报道较少,对其的检测方法主要为常规的RT-PCR方法,该方法仅能对DAstV-3进行定性诊断,但不能定量分析。本研究对1株新分离获得的DAstV-3（命名为GX1806株）进行全基因组序列分析,并建立了针对该病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法,为深入研究DAstV-3的遗传变异情况和该病的早期快速诊断提供有效的技术支撑。本研究从广西临床样品中分离获得1株DAstV-3（GX1806株）,应用RT-PCR方法对病毒GX1806株基因组进行分段扩增。对测序结果进行编辑、拼接后获得GX1806株基因组序列。基因组序列分析显示,GX1806株基因组全长7463nt,具有星状病毒基因组典型特征,包含ORF1a、ORF1b和ORF2三个开放阅读框。ORF1a和ORF1b的重合区域存在AAAAAAC的七碱基滑动序列,ORF1b中存在对单股正链RNA病毒复制中不可或缺的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RDRP）基因。遗传进化分析表明,GX1806株与GenBank中CPH株的亲缘关系最近,全基因组序列同源性达到96.87%。为建立一种DAstV-3的实时荧光定量检测方法,本研究扩增出RDRP基因一段609 bp大小的保守区域,并将该扩增片段克隆至pMD18-T载体上。将该质粒进行10倍梯度稀释,作为标准品模板来进行实时荧光定量PCR扩增,建立了实时荧光定量PCR标准曲线。当RDRP基因含量在1.15×102拷贝/μL1.15×108拷贝/μL时,循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.997,扩增效率为99.9%。建立的DAstV-3实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为1.15×102拷贝/μL,敏感性为常规RT-PCR检测方法的1000倍;特异性强,对常见病毒（如禽流感病毒、鸭呼肠孤病毒、坦布苏病毒、鸭甲肝病毒等以及鸭星状病毒1型和鸭星状病毒2型）的检测均呈阴性。重复性结果表示组内重复变异系数为0.14%0.65%、组间重复变异系数为0.53%2.20%,表明重复性良好。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为59.5%（22/37）,常规PCR方法的阳性率为43.2%（16/37）,2种方法的符合率为100%。以上结果表明本研究首次建立的基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR检测方法可用于临床中对DAstV-3引起疾病的早期诊断。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1 星状病毒的认识
•     1.1 星状病毒感染禽类的概述
•     1.2 星状病毒的分类
•     1.3 星状病毒的形态特征
•     1.4 星状病毒的理化性质
•     1.5 星状病毒的基因组结构
•     1.6 星状病毒的检测手段
•     1.7 研究的目的与意义
• 第二章 DAstV-3 GX1806 株的分离与鉴定
•   1.材料与方法
•     1.1 材料
•     1.2 方法
•   2.结果与分析
•     2.1 病毒的RT-PCR鉴定结果
•     2.2 病毒的分离培养结果
•     2.3 GX1806 DastV-3 鸭胚分离物的外源病毒检测结果
•   3.讨论
• 第三章 DASTV-3 GX1806 株全基因组测定及序列分析
•   1 材料与方法
•     1.1 材料
•     1.2 方法
•   2 结果与分析
•     2.1 GX1806 全基因组测定结果及分析
•   3 讨论
• 第四章 DASTV-3 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法的建立
•   1 材料与方法
•     1.1 材料
•     1.2 方法
•   2 结果与分析
•     2.1 Dastv-3 实时荧光定量PCR检测条件的优化
•     2.2 DAstv-3 实时荧光定量PCR的标准曲线
•     2.3 Dastv-3 实时荧光定量PCR的溶解曲线
•     2.4 Dastv-3 实时荧光定量PCR的特异性分析
•     2.5 Dastv-3 实时荧光定量PCR的重复性分析
•     2.6 Dastv-3 实时荧光定量PCR的灵敏性分析
•     2.7 Dastv-3 实时荧光定量PCR对临床样品的分析
•   3 讨论
• 结论
• 创新点
• 尚需进一步深入研究的内容
• 参考文献
• 攻读学位期间的学术论文与研究成果
• 致谢
• 附录1 GX1806 全基因组序列

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张蕊

导师: 梅景良,黄瑜

关键词: 鸭星状病毒型,全基因组序列,实时荧光定量

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 福建农林大学

分类号: S852.65

总页数: 59

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