SUMO融合表达对淀粉酶N-Amy活性的影响

论文摘要

前期解析了一个来自嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的新型的碱性淀粉酶Amy703,该酶含有一个未知功能的N端结构域,将该结构域缺失后得到的突变体N-Amy相对野生型Amy703比酶活提高了35倍;底物结合实验显示Amy703可以结合不可溶性底物,单独的N端结构域和N端结构域缺失突变体N-Amy都不能结合,推测N端结构域会造成催化结构域的结构变化从而引起比酶活的大幅提高.为了进一步探究Amy703特异的N端结构域造成酶活显著下降的原因,将Amy703的N端结构域替换为SUMO蛋白,实验结果显示裂解液上清的SUMO/N-Amy条带比Amy703粗亮,验证了SUMO蛋白的促可溶性作用;但纯化后的融合蛋白SUMO/N-Amy的比酶活显著低于N-Amy,仅和野生型Amy703的比酶活相当,表明SUMO与N-Amy的融合显著降低了酶活,同时也预示着N端多一段结构域会影响到催化结构域的结构变化.此外,对SUMO/N-Amy融合蛋白是否与底物结合进行了探讨,为进一步解析Amy703的N端结构域功能提供了实验依据.

论文目录

• 0 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 试剂与耗材
•   1.2 本研究所用引物本文中使用的引物有4条, 具体为
•   1.3 载体的构建
•   1.4 融合蛋白的表达纯化
•   1.5 酶活测定方法
•   1.6 底物结合实验
• 2 结果与讨论
•   2.1 载体p ET28a-sumo/N-Amy的构建
•   2.2 融合蛋白SUMO/N-Amy的诱导表达纯化
•   2.3 SUMO/N-Amy蛋白的酶活测定
•   2.4 SUMO/N-Amy的底物结合实验
•     2.4.1 底物结合实验检测是否结合底物
•     2.4.2 酶液适当稀释后的底物结合实验
•     2.4.3 添加Ca2+进行底物结合实验
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王美星,向腊,胡慧贞,巫攀,张桂敏

关键词: 碱性淀粉酶,端结构域,蛋白,底物结合能力,比酶活

来源: 湖北大学学报(自然科学版) 2019年03期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 湖北大学生命科学学院

基金: 国家自然科学基金(31670069),湖北省自然科学基金杰出青年人才基金(2018CFA042)资助

分类号: Q556.2

页码: 217-222

总页数: 6

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