氮缺乏条件下蛋白核小球藻脂肪酸饱和度的变化及脂肪酸去饱和酶功能分析

论文摘要

缺氮培养条件能够引起微藻脂肪酸组成的变化,而生物柴油的品质与微藻脂肪酸的组成密切相关。由于缺乏微藻脂肪酸饱和度变化的分子机理研究,严重限制了微藻生物柴油的商业化进程。本课题研究氮浓度对微藻脂肪酸饱和度的影响及分子机理,探究了在不同硝酸盐浓度下蛋白核小球藻（Auxenochlorella pyrenoidosa）脂肪酸组分动态变化情况以及Delta9,Delta12和Delta15脂肪酸去饱和酶（Δ9FAD,Δ12FAD和Δ15FAD）转录水平。结果表明氮能够诱导蛋白核小球藻十八碳脂肪酸的去饱和作用,在硝酸盐浓度为1.5 g L-1培养基中,蛋白核小球藻中亚麻酸（C18:3）组分高达30.60%。相反,在硝酸盐浓度为0 g L-1时,油酸（C18:1）含量显著积累至34.40%,而C18:3含量下降。在0 g L-1硝酸盐浓度条件下,Δ9FAD在对数生长期转录水平显著提升330%以及Δ15FAD下调14%引起C18:1的积累和C18:3的下降。氮回补导致Δ9FAD的表达量下降至氮浓度为0 g L-1条件下的1%,伴随着C18:1从34.79%迅速下降至0.22%。以上结果表明Δ9FAD在氮缺乏条件下对C18:1的积累发挥了重要作用。进而将Δ9FAD在大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达引起C18:1含量提升,验证了Δ9FAD的功能。研究结果表明氮缺乏能够诱导蛋白核小球藻Δ9FAD的表达,进而积累用于生产生物柴油的优质脂肪酸组分C18:1。本研究为通过代谢工程提升微藻生物柴油品质提供了新的方法,对微藻生物柴油的商业化发展具有重要的指导意义。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词对照表
• 第一章 绪论
•   1.1 微藻生物能源研究
•     1.1.1 生物能源的研究现状
•     1.1.2 微藻生物能源
•     1.1.3 微藻生物柴油特性
•   1.2 环境因子对微藻脂肪酸组成的影响
•     1.2.1 环境因素对脂肪酸组分的影响
•     1.2.2 环境因子对微藻极性脂和中性脂脂肪酸饱和度的影响
•   1.3 脂肪酸合成途径
•   1.4 脂肪酸去饱和酶的研究进展
•     1.4.1 Δ4FAD基因
•     1.4.2 Δ5FAD基因
•     1.4.3 Δ6FAD基因
•     1.4.4 Δ9FAD基因
•     1.4.5 Δ12FAD基因
•     1.4.6 Δ15FAD基因
•   1.5 基因工程改造在微藻脂肪酸合成调控中的应用
•   1.6 本课题的提出以及研究目的意义
•     1.6.1 研究目的意义
•     1.6.2 主要研究内容
•     1.6.3 研究技术路线
•     1.6.4 创新点
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 藻种
•     2.1.2 培养基
•     2.1.3 仪器设备
•   2.2 微藻生长的测定
•     2.2.1 微藻细胞生长曲线的绘制
•     2.2.2 微藻细胞干重的测定
•   2.3 培养基中氮浓度检测
•   2.4 微藻细胞油脂测定
•     2.4.1 油脂含量测定
•     2.4.2 不同脂质组分的分离
•     2.4.3 脂肪酸组成的测定
•   2.5 生物柴油特性测定
•   2.6 蛋白核小球藻Δ9FAD、Δ12FAD、Δ15FAD转录水平测定
•     2.6.1 提取RNA
•     2.6.2 cDNA第一链的合成
•     2.6.3 cDNA特异片段的PCR扩增
•     2.6.4 目的片段的回收
•     2.6.5 连接T载体
•     2.6.6 制备大肠杆菌感受态细胞
•     2.6.7 大肠杆菌转化
•     2.6.8 筛选阳性克隆及测序
•     2.6.9 实时荧光定量PCR
•   2.7 目的基因外源表达
•     2.7.1 目的基因在大肠杆菌中表达
•     2.7.2 目的基因在酵母中表达
•     2.7.3 定点突变
• 第三章 氮浓度对微藻脂肪酸组成及生物柴油特性的影响
•   3.1 蛋白核小球藻在不同氮浓度条件下的生长状况
•     3.1.1 实验设计
•     3.1.2 蛋白核小球藻在不同硝酸盐浓度条件下的生长状况
•     3.1.3 蛋白核小球藻的脂质含量在不同氮浓度条件下的变化情况
•     3.1.4 微藻在不同硝酸盐浓度下的脂肪酸组成
•     3.1.5 小结
•   3.2 蛋白核小球藻脂肪酸在不同氮浓度条件下的动态变化
•     3.2.1 实验设计
•     3.2.2 极性脂和中性脂中脂肪酸组成
•     3.2.3 不同硝酸盐浓度下微藻脂肪酸组成的动态变化情况
•     3.2.4 培养基中硝酸盐消耗情况
•     3.2.5 小结
•   3.3 氮回补实验
•     3.3.1 实验设计
•     3.3.2 蛋白核小球藻在回补硝酸盐前后的生长状况
•     3.3.3 蛋白核小球藻在回补硝酸盐前后的脂肪酸组成
•     3.3.5 小结
•   3.4 微藻在不同氮浓度条件下生产的生物柴油特性
•   3.5 本章小结
• 第四章 氮浓度对蛋白核小球藻脂肪酸去饱和酶转录水平的影响及关键基因的功能验证
•   4.1 不同硝酸盐浓度下Δ9FAD、Δ12FAD和 Δ15FAD转录水平的变化
•     4.1.1 实验设计
•     4.1.2 Δ9FAD、Δ12FAD和Δ15FAD的克隆和测序
•     4.1.3 绘制Δ9FAD、Δ12FAD和Δ15FAD荧光定量标准曲线
•     4.1.4 Δ9FAD、Δ12FAD和Δ15FAD在不同氮浓度条件下转录水平的变化
•     4.1.5 测定Δ9FAD、Δ12FAD和Δ15FAD在氮回补前后转录水平的变化
•     4.1.6 小结
•   4.2 Δ9FAD、Δ12FAD和Δ15FAD基因在大肠杆菌中表达
•     4.2.1 实验设计
•     4.2.2 Δ9FAD基因在大肠杆菌中表达
•     4.2.3 Δ12FAD和Δ15FAD基因在大肠杆菌中表达
•     4.2.4 小结
•   4.3 Δ9FAD、Δ12FAD和Δ15FAD基因在酿酒酵母中表达
•     4.3.1 实验设计
•     4.3.2 Δ9FAD基因在酿酒酵母中表达
•     4.3.3 Δ12FAD和Δ15FAD基因在酿酒酵母中表达
•     4.3.4 小结
•   4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录1
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张琦

导师: 缪晓玲

关键词: 氮浓度,脂肪酸饱和度,蛋白核小球藻,基因表达

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海交通大学

基金: 国家自然科学基金委员会(No.41476122)

分类号: Q949.9

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.002803

总页数: 101

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