基于植物病毒外壳蛋白靶标的药剂筛选与作用机理研究

论文摘要

近年来,植物病毒病害在农业生产过程中给农产品质量和数量带来了巨大损失,其中以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）引起的病毒病害尤为严重。虽然目前对该病害的基础研究有所进展,市面上也有少数几种药剂能有效地治理该种病害,但其具体的作用机理尚不清楚,导致研发针对该病原体的特效性药剂难度极大。如何有效地筛选抗PVY药物是防治马铃薯病毒病害的关键问题,因此建立一个以PVY关键蛋白为潜在靶标的药物筛选模型,寻找高活性的抗PVY药物,对防治马铃薯病毒病具有重要意义。本论文以原核表达纯化的马铃薯Y病毒外壳蛋白（Coat protein,CP）为靶标,利用等温量热滴定法、微量热泳动法、农杆菌介导法和蛋白免疫印迹法研究PVY-CP与抗病毒小分子之间的相互作用,测得PVY-CP与抗病毒小分子之间的结合常数、结合位点数及主要作用形式。以药物与PVY-CP的作用力为指标,进行离体水平的抗PVY药物筛选。后续通过突变体蛋白和活体植株的两种验证实验初步探究药剂的作用机理,建立了基于PVY-CP为潜在靶标的药物筛选模型。研究结果表明,在体外,病毒唑、盐酸吗啉胍与PVY-CP均有不同程度的结合力,其结离常数大小为病毒唑（4.56μM）<盐酸吗啉胍（77.6μM）,而氨基寡糖、苯并噻二唑与PVY-CP没有相互结合;继而研究了杨梅素衍生物与PVY-CP的相互作用,结果表明LP4、LP6、LP9和LP17与PVY-CP均有不同程度的结合力,其中LP6和LP9与PVY-CP的结合力比LP4和LP17与PVY-CP的结合力强。通过突变体蛋白的验证实验明确了病毒唑与PVY-CP的结合位点为精氨酸（R）153、精氨酸（R）179、天冬氨酸（D）197和赖氨酸（K）217。通过活体验证实验表明了病毒唑对PVY-CP在活体植株内的表达有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词列表
• 前言
• 第一章 文献综述
•   1.1 PVY的危害及传播途径
•   1.2 PVY在基因及蛋白方面的研究进展
•   1.3 杨梅素衍生物的药理学研究
•   1.4 药物小分子与蛋白的体外互作方法的研究
•     1.4.1 MST技术
•     1.4.2 ITC技术
•     1.4.3 分子对接技术
•   1.5 高活性药剂的体内活体验证
•     1.5.1 农杆菌介导的植物转基因技术
•     1.5.2 农杆菌介导的植物转基因研究现状
•     1.5.3 蛋白免疫印迹法
•   1.6 本章小结
• 第二章 设计思路与研究路线
•   2.1 研究的目的和意义
•   2.2 拟解决的关键问题
•   2.3 研究内容
•     2.3.1 PVY-CP的原核表达载体构建及蛋白纯化表达与鉴定
•     2.3.2 抗病毒药剂分别与野生型和突变型PVY-CP的相互作用
•     2.3.3 高活性药剂的体内活体验证
•   2.4 技术路线
• 第三章 实验材料与方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 质粒与表达菌株
•     3.1.2 供试蛋白和抗植物病毒小分子
•     3.1.3 实验试剂
•     3.1.4 主要仪器设备
•     3.1.5 主要缓冲溶液的配制方法
•   3.2 PVY-CP的载体构建
•     3.2.1 烟草总RNA的提取
•     3.2.2 cDNA的合成
•     3.2.3 PCR扩增
•     3.2.4 T4 ase酶连接PVY-CP基因和pET28a质粒
•     3.2.5 双酶切PVY-CP基因和pET28a质粒
•   3.3 PVY-CP的表达纯化
•     3.3.1 感受态细胞的制备
•     3.3.2 pET28a-His-PVY-CP重组质粒的转化
•     3.3.3 PVY-CP的表达
•     3.3.4 PVY-CP的纯化
•   3.4 PVY-CP的验证
•     3.4.1 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证PVY-CP目的蛋白
•     3.4.2 通过高分辨质谱仪鉴定PVY-CP目的蛋白
•   3.5 PVY-CP与抗病毒药剂的相互作用研究
•     3.5.1 ITC研究PVY-CP蛋白与抗病毒小分子的相互作用
•     3.5.2 MST研究PVY-CP蛋白与抗病毒小分子的相互作用
•   3.6 高活性药剂的体内活体验证
•     3.6.1 农杆菌感受态的制备
•     3.6.2 农杆菌转化
•     3.6.3 农杆菌注射接种
•     3.6.5 喷施药剂并进行WB分析
• 第四章 结果与讨论
•   4.1 重组质粒的构建
•     4.1.1 双酶切验证pET28a-PVY-CP重组载体
•     4.1.2 pET28a-PVY-CP（wt）重组载体的测序鉴定
•   4.2 PVY-CP蛋白的鉴定
•     4.2.1 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定目标蛋白
•     4.2.2 通过高分辨质谱鉴定目标蛋白
•   4.3 抗病毒药剂与PVY-CP体外互作研究
•     4.3.1 MST研究抗病毒药剂与PVY-CP体外互作
•     4.3.2 ITC研究抗病毒药剂与PVY-CP体外互作
•   4.4 药物小分子与PVY-CP分子对接情况
•   4.5 突变型PVY-CP的鉴定与纯化
•   4.6 抗病毒药剂与突变型PVY-CP体外互作研究
•     4.6.1 MST研究抗病毒药剂与突变型PVY-CP体外互作
•     4.6.2 ITC研究抗病毒药剂与突变型PVY-CP体外互作
•   4.7 高活性药剂的体内活体验证
• 第五章 结论
•   5.1 主要结论
•     5.1.1 PVY-CP原核表达载体的构建及蛋白纯化鉴定
•     5.1.2 抗病毒药剂与PVY-CP体外互作研究
•     5.1.3 抗病毒药剂与突变型PVY-CP体外互作研究
•     5.1.4 高活性药剂的体内活性验证
•   5.2 本论文的创新之处
•   5.3 本论文的不足与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
•   1.课题来源
•   2.研究生期间发表的论文
•   3.抗病毒药剂及杨梅素衍生物结构式
•   4.附图

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高迪

导师: 李向阳

关键词: 马铃薯病毒外壳蛋白,相互作用,等温量热滴定法,微量热泳动法,农杆菌介导法

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护

单位: 贵州大学

基金: 国家自然科学基金,抗植物病毒抑制剂烟草花叶病毒外壳蛋白复制的作用机制研究,课题编号:21502032

分类号: S432.41

总页数: 66

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