转NtLTP4基因抗盐抗旱抗病马铃薯新材料的培育

论文摘要

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是全球第四大粮食作物,仅次于小麦、稻谷和玉米。2015年,农业部将马铃薯主粮化工作列入重要议程。马铃薯在我国的种植范围很广,环境胁迫是限制马铃薯产量和品质进一步提高的主要瓶颈之一。马铃薯在受到环境胁迫后,会有不同程度的减产,严重的甚至减产70%左右。前期,我们从烟草中克隆得到一个编码非特异性脂转移蛋白的基因Nt LTP4,研究表明,超表达Nt LTP4基因能够增强烟草对非生物胁迫和生物胁迫的耐受性。在此基础上,本研究开展了Nt LTP4基因转化马铃薯的研究,培育获得了抗盐碱、干旱和青枯病的马铃薯新种质,为马铃薯品种改良奠定了基础。主要的研究结果和结论如下:（1）ubi3启动子的克隆及表达活性分析利用PCR技术,从马铃薯克隆了ubi3启动子,该启动子长度为921bp。将ubi3启动子插入p X6载体中,获得载体ubi3::p X6。进而,在载体ubi3::p X6中ubi3启动子的下游插入GFP基因,构建带GFP标签植物表达载体ubi3::p X6-GFP。用载体ubi3::p X6-GFP侵染烟草,2d后在上部叶片观察到荧光,说明ubi3具有启动子活性,可以启动下游基因的正常表达。（2）Nt LTP4基因过表达载体的构建及基因转化设计含有适宜酶切位点的引物,PCR克隆Nt LTP4基因,插入载体ubi3::pX6的ubi3启动子下游,获得了Nt LTP4基因过表达载体ubi3::p X6-Nt LTP4。将ubi3::p X6-Nt LTP4载体导入农杆菌,利用农杆菌介导法转化马铃薯,共获得了18个株系。PCR检测结果显示,其中15株为Nt LTP4阳性株系;进一步的q RT-PCR检测结果显示,株系L2、L9、L11、L12、L13中Nt LTP4基因的表达量较高。对这5个株系进行Southern blot检测,结果显示5个株系都检测到了杂交信号,且信号条带数量1-4条,表明在这些转基因植株中至少存在1-4个拷贝Nt LTP4基因;Western blot检测结果显示,5个株系都检测到了蛋白杂交信号,蛋白分子大小约为12KDa,表明这些转基因株系中Nt LTP4基因都成功表达。（3）Nt LTP4过表达马铃薯株系的抗逆性鉴定根据基因表达的检测结果,从Nt LTP4过表达马铃薯株系中选取了Nt LTP4表达量较高的3个株系（L11、L12、L13）进行盐胁迫、干旱胁迫以及侵染青枯菌,对其抗逆性进行检测。结果显示,转基因马铃薯株系在高盐环境下长势优于野生型马铃薯,而且Nt LTP4表达量越高,马铃薯的耐盐性越强;转基因株系在干旱条件下的存活率高于野生型株系,且Nt LTP4表达量越高,马铃薯的存活率越高,对干旱的耐受性效果越好;接种青枯菌的转基因株系发病率以及发病程度都低于野生型株系,且Nt LTP4的表达量越高,马铃薯的青枯病发病率、发病程度越低,对青枯菌的抗性更强。上述结果表明过表达Nt LTP4能够提高马铃薯对非生物胁迫（高盐、干旱）以及生物胁迫（青枯菌）的抗性,且该基因表达量越高,植物的对非生物和生物胁迫的耐受性越好。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 环境胁迫对马铃薯生产的影响
•   1.2 马铃薯抗非生物和生物胁迫育种研究进展
•   1.3 非特异性脂转移蛋白的相关研究进展
•     1.3.1 非特异性脂转移蛋白的发现
•     1.3.2 非特异性脂转移蛋白的分类
•     1.3.3 非特异性脂转移蛋白的结构
•     1.3.4 非特异性脂转移蛋白的生物学功能
•   1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 质粒和菌株
•     2.1.3 常用培养基、试剂以及实验仪器
•     2.1.4 PCR引物
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 目的基因的扩增
•     2.2.2 DNA片段的回收（试剂盒法）
•     2.2.3 目的基因DNA片段与克隆载体的连接
•     2.2.4 大肠杆菌感受态制备
•     2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的转化
•     2.2.6 转化菌落PCR鉴定
•     2.2.7 质粒DNA的小量提取（试剂盒法）
•     2.2.8 质粒DNA的酶切
•     2.2.9 目的片段与质粒DNA的连接
•     2.2.10 根癌农杆菌感受态的制备
•     2.2.11 冻融法转化农杆菌
•     2.2.12 马铃薯ubi3 启动子的克隆及表达活性分析
•       2.2.12.1 马铃薯ubi3 启动子瞬时表达载体的构建
•       2.2.12.2 农杆菌瞬时侵染烟草
•     2.2.13 NtLTP4 植物过表达载体的构建
•     2.2.14 农杆菌介导的马铃薯转化及转基因株系的获得
•     2.2.15 转基因植株的鉴定
•       2.2.15.1 植物基因组DNA的少量提取（简易法）
•       2.2.15.2 转基因株系的PCR检测
•     2.2.16 转基因株系NtLTP4 基因表达量的检测
•       2.2.16.1 植物总RNA的提取
•       2.2.16.2 反转录合成c DNA
•       2.2.16.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
•     2.2.17 转基因株系的Southern blot分析
•       2.2.17.1 植物基因组DNA的大量提取（平衡酚法）
•       2.2.17.2 探针合成（地高辛标记）
•       2.2.17.3 DIG-High标记探针的有效性检测
•       2.2.17.4 转基因植株总DNA的酶切
•       2.2.17.5 DNA琼脂糖凝胶电泳
•       2.2.17.6 DNA转膜
•       2.2.17.7 预杂交与杂交
•       2.2.17.8 洗膜与显影
•     2.2.18 转基因马铃薯株系的Western blot检测
•       2.2.18.1 植物组织蛋白质的提取
•       2.2.18.2 SDS聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳
•       2.2.18.3 蛋白转膜（湿法转移法）
•       2.2.18.4 化学发光法检测蛋白含量
•       2.2.18.5 蛋白显影
•     2.2.19 转基因马铃薯株系的非生物胁迫处理
•     2.2.20 转基因马铃薯株系的生物胁迫处理
•     2.2.21 组织化学染色方法
• 3 结果与分析
•   3.1 ubi3 启动子的克隆与表达活性分析
•     3.1.1 ubi3 启动子的克隆
•     3.1.2 ubi3 启动子的表达活性分析
•   3.2 NtLTP4 基因过表达载体的构建
•     3.2.1 烟草NtLTP4 的扩增
•     3.2.2 NtLTP4 植物过表达载体的构建
•   3.3 转NtLTP4 基因马铃薯株系的获得与鉴定
•     3.3.1 转NtLTP4 基因马铃薯株系的获得
•     3.3.2 转NtLTP4 基因马铃薯株系的鉴定
•       3.3.2.1 转NtLTP4 基因马铃薯株系的PCR鉴定
•       3.3.2.2 转基因马铃薯株系NtLTP4 基因表达水平的检测
•       3.3.2.3 转基因马铃薯株系的Southern blot分析
•       3.3.2.4 转基因马铃薯株系的Western blot分析
•   3.4 NtLTP4 的过表达增强了转基因马铃薯对非生物胁迫的抗性
•     3.4.1 转NtLTP4 基因马铃薯株系对盐胁迫的抗性增强
•     3.4.2 过表达NtLTP4 提高了马铃薯对干旱胁迫的耐受性
•   3.5 过表达NtLTP4 提高了转基因马铃薯对青枯菌的抗性
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邢仪

导师: 朱常香,张晓英

关键词: 转基因马铃薯,非生物胁迫,生物胁迫,马铃薯品种改良

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 山东农业大学

分类号: S532;Q943.2

总页数: 67

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