牛源无乳链球菌菌毛岛屿AP2蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

论文摘要

目的构建牛源无乳链球菌AP2蛋白原核表达质粒,表达AP2蛋白,并以此为包被抗原建立检测无乳链球菌抗体的ELISA方法。方法取pMD18-T-AP2和pET-30a（+）分别进双酶切,酶切片段连接后转染BL21（DE3）细胞,进行AP2的诱导表达及鉴定。以重组AP2为抗原建立检测无乳链球菌抗体的ELISA方法,并用无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌感染兔血清进行检测。结果双酶切及PCR鉴定重组质粒构建正确。Western blot分析表明重组AP2蛋白具有反应原性,建立的间接ELISA抗原最佳包被浓度为25μg/ml,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶70。抗体滴度检测显示重组AP2具有良好的免疫原性,3次免疫（56 d）的兔血清抗体滴度达1∶10 000。用该方法检测化脓性链球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌感染兔血清,均未出现交叉阳性反应。结论成功表达了重组无乳链球菌菌毛岛屿AP2蛋白,建立的间接ELISA方法稳定性高,特异性良好,可用于无乳链球菌感染检测。

论文目录

• 材料与方法
•   1 材料
•     1.1 菌株
•     1.2 主要试剂
•   2 方法
•     2.1 抗血清制备
•     2.2 重组质粒PET30a-AP2的构建
•     2.3 重组AP2蛋白的诱导表达、纯化与鉴定
•     2.4 重组AP2间接ELISA方法的建立
•       2.4.1 最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释度的筛选
•       2.4.2 酶标二抗最佳工作浓度及反应时间的优化
•       2.4.3 临界值确定
•     2.5 交叉反应性试验
•     2.6 免疫血清抗体滴度检测
• 结 果
•   1 重组质粒PET30a-AP2的构建及鉴定
•   2 重组蛋白的诱导表达、纯化与 Western blot鉴定
•   3 AP2间接ELISA检测方法的建立
•     3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度
•     3.2 酶标二抗（羊抗兔IgG）最佳稀释浓度及最佳反应时间
•     3.3 阳性临界值
•     3.4 试验的交叉反应性
•     3.5 重组AP2免疫血清抗体滴度
• 讨 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 锡林高娃,韩甫鑫,杜长智,布日额

关键词: 无乳链球菌,基因,原核表达,间接

来源: 中国病原生物学杂志 2019年10期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 内蒙古民族大学生命科学学院内蒙古民族大学乳源性致病菌研究所

基金: 内蒙古自治区高等学校科学研究课题(No.NJZY172),内蒙古自治区乳源性致病菌防控工程技术研究中心开放课题(No.MDK2016038),内蒙古自治区乳源性致病菌防控工程技术研究中心开放课题(No.MDK2017019)

分类号: S852.611

DOI: 10.13350/j.cjpb.191012

页码: 1178-1180+1185

总页数: 4

文件大小: 1356K

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