细胞色素Cyp17a2在尼罗罗非鱼类固醇合成及配子发生过程中的功能研究

论文摘要

细胞色素P450（cytochrome P450或CYP）是以亚铁血硫素为辅基的细胞色素蛋白酶基因超级族,以其一氧化碳结合物在450 nm处的光吸收峰命名。Cyp17a（cytochrome P450,family 17 and subfamily A）基因属于细胞色素P450超家族,对于性腺和头肾中C18、C19、C21激素的合成很重要。在硬骨鱼类中普遍存在两个复制基因cyp17a1和cyp17a2。早期研究表明Cyp17a1具有羟化酶和裂解酶的活性,仅在性腺中表达,对于雌、雄激素的合成非常重要。而Cyp17a2只具有羟化酶的活性,在头肾和性腺中表达,并且在罗非鱼配子成熟时期的滤泡细胞表达上调,可能参与鱼类头肾中皮质醇和性腺中孕激素DHP（17a,20b,21-trihydroxy-4-pregnen-3-one）的合成。但未见关于Cyp17a2在鱼类类固醇合成和配子发生过程中的功能研究的报道,因此本研究以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为实验动物,采用CRISPR/Cas9技术成功建立cyp17a2基因纯合敲除系,研究cyp17a2基因突变对性腺发育、配子发生、类固醇生成和精子活力与育性等的影响。本论文的主要研究结果如下:1)Cyp17a基因在性腺及头肾中的表达及细胞定位。Real-time的数据表明cyp17a1和cyp17a2在孵化后60天（day after hatching,dah）之前,卵巢中的表达量高于精巢,之后在精巢中高表达。免疫组化表明,Cyp17a1从5 dah开始在XX个体卵巢的体细胞表达,后期表达于卵巢的间质细胞和颗粒细胞。在XY个体从10 dah开始表达于精巢的体细胞,后期表达于leydig细胞中。Cyp17a2从10 dah开始表达于XX个体卵巢体细胞,后期表达于间质细胞和鞘膜细胞,在XY从90dah开始表达于精巢的leydig细胞。在头肾中没有检测到Cyp17a1的表达,Cyp17a2从5 dah开始表达于肾间细胞。2)Cyp17a2基因纯合突变系的建立。利用CRISPR/Cas9技术在罗非鱼中敲除cyp17a2,并获得纯合突变鱼。Sanger测序及聚丙烯酰氨凝胶电泳的结果都显示成功获得cyp17a2突变系。免疫组化和Western blot的结果同样显示,cyp17a2-/-的卵/精巢中没有Cyp17a2蛋白的表达。3)Cyp17a2基因突变对类固醇合成酶及类固醇激素合成水平的影响。分别在cyp17a2+/+和cyp17a2-/-的90 dah和180 dah时,Real-time发现,cyp17a1和cyp19a1a在卵巢中的表达水平以及cyp17a1和cyp11b2在精巢中的mRNA和蛋白表达水平没有明显变化,并且血清中雌、雄激素也没有显著的差异,这说明Cyp17a2可能不参与雌、雄激素的合成。与对照雌鱼相比,cyp17a2-/-雌鱼不能正常产卵。血清DHP的水平在雌鱼产卵周期第八天出现峰值,而在敲除鱼中无论是否用hCG处理,血清中DHP的水平显著低于对照组。在cyp17a2-/-雌雄鱼头肾中没有Cyp17a2的表达,血清中皮质醇合成水平都显著降低。这些结果说明,Cyp17a2可能参与性腺中DHP的合成及头肾中皮质醇的合成。4)Cyp17a2基因突变对雌鱼性腺发育及卵子发生的影响。在90和120 dah,H.E.（hematoxylin-eosin staining）检测发现cyp17a2-/-卵巢中基本上观察不到卵母细胞,生殖细胞处于卵原细胞阶段;到180 dah时能够观察到III时相的卵母细胞,表明卵子发生已经得到一定程度的恢复。在90 dah,免疫组化显示cyp17a2-/-卵巢中没有检测到雄性特异基因的表达,表明cyp17a2缺失不会导致由雌向雄的性逆转,同样没有检测到I、II时相卵母细胞的marker 42sP50信号,RA合成酶Aldh1a2的信号减弱。Real-time的结果显示,在90 dah,卵巢中vasa和piwil的表达降低,RA的合成酶aldh1a2的表达显著降低,分解酶cyp26b1的表达显著升高,同时,减数分裂的标志基因spo11和sycp3的表达显著降低。在180 dah,aldh1a2和cyp26b1的表达量无显著的差异,spo11和sycp3的表达显著升高。这表明cyp17a2基因的缺失会导致卵巢中生殖细胞的减数分裂的起始延迟,到后期得到一定的恢复。在90 dah,性腺中fshr和lhr的水平显著降低;在180 dah,垂体中fshβ和lhβ的表达水平未出现显著的差异,性腺中fshr的表达升高,lhr的水平依然显著低于对照组。上述的结果表明,Cyp17a2可能通过改变DHP或RA的合成,调控卵母细胞减数分裂的起始,进而影响卵母细胞的最终成熟和排卵。5)Cyp17a2基因突变对雄鱼性腺发育及精子发生的影响。在75 dah时,H.E.检测发现cyp17a2+/+精巢中能够观察到精子发生已经进行,精巢中存在少量的精母细胞,cyp17a2-/-精巢中基本上观察不到减数分裂的细胞存在;在90 dah时,cyp17a2+/+精巢已经进行到精子细胞阶段,cyp17a2-/-精巢还停留在初级精母细胞阶段;到180 dah时,cyp17a2-/-精子发生赶上cyp17a2+/+的精子发生。表明Cyp17a2在早期精子发生过程中发挥着重要的作用,cyp17a2缺失导致减数分裂的起始延迟,到后期精子发生得到恢复。免疫组化和Real-time的结果显示,在90 dah时,vasa和piwil的表达显著降低,cyp26b1的表达显著升高,spo11和sycp3的表达显著降低;在180 dah时,cyp26b1的表达在两组之间无显著差异,spo11和sycp3的表达显著升高。这表明Cyp17a2对于精子发生的减数分裂的起始非常重要,cyp17a2的缺失会导致精子发生过程的延迟。巴氏染色发现,cyp17a2突变对于精子的形态没有明显的影响。但cyp17a2突变导致前向运动精子所占的比例降低,不活动精子的比例升高,且精子直线和曲线运动速率降低,表明cyp17a2突变对于精子的活力有一定的影响。综上所述,本研究利用基因编辑技术成功建立cyp17a2基因敲除系,发现Cyp17a2在罗非鱼中可能不参与雌、雄激素的合成,而对于皮质醇及DHP的合成非常重要。cyp17a2基因突变导致生殖细胞的减数分裂的起始延迟,影响雌鱼卵子的最终成熟和排卵,以及雄鱼精子的活力。本研究首次在鱼类中探究了cyp17a2基因在类固醇生成和配子发生过程中所扮演的角色。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
•   1 脊椎动物配子发生过程
•     1.1 精子发生
•       1.1.1 哺乳动物精子发生
•       1.1.2 鱼类精子发生
•     1.2 卵子发生
•       1.2.1 哺乳动物卵子发生
•       1.2.2 鱼类卵子发生
•   2 类固醇激素与配子发生
•     2.1 雌激素
•     2.2 雄激素
•     2.3 孕激素及其受体
•   3 类固醇合成酶编码基因cyp17a的研究进展
•   4 科学问题的提出和本研究目的意义
• 第2章 细胞色素Cyp17a2 在尼罗罗非鱼类固醇生成和配子发生过程中的作用
•   1 引言
•   2 材料和方法
•     2.1 实验动物
•     2.2 仪器和试剂
•     2.3 实验方法
•   3 实验结果
•     3.1 Cyp17a1和cyp17a2 基因在罗非鱼中的表达模式
•     3.2 Cyp17a1和cyp17a2 在罗非鱼性腺中的细胞定位
•     3.3 Cyp17a2 基因纯合敲除系的鉴定和筛选
•     3.4 Cyp17a2 基因突变对类固醇合成酶及类固醇激素合成的影响
•     3.5 Cyp17a2 基因突变对罗非鱼性腺发育和配子发生的影响
•   4 讨论
•     4.1 Cyp17a2 基因突变对激素合成的影响
•     4.2 Cyp17a2 基因突变对罗非鱼减数分裂起始的影响
•     4.3 Cyp17a2 基因突变对罗非鱼卵子成熟及排卵的影响
•     4.4 Cyp17a2 基因突变对罗非鱼精子形态、活力的影响
• 结论
• 本研究的不足与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的论文
• 在读期间参加科研情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨兰英

导师: 周林燕

关键词: 类固醇生成,配子发生

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西南大学

基金: 国家自然科学面上项目(31772825),面上项目(31572597),中央高校基本科研业务费创新团队项目(XDJK2015A004)

分类号: Q953

DOI: 10.27684/d.cnki.gxndx.2019.000003

总页数: 82

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