肠炎沙门菌nmpC基因缺失株的生物学特性及免疫效果分析

论文摘要

肠炎沙门菌（Salmonella enteritis）为肠道胞内菌,能引起胃肠炎、腹泻,感染严重者可导致死亡,是一种严重的人畜共患菌。抗生素常常成为控制沙门菌的首选,近几年沙门菌对抗生素产生耐药性,不能有效的治疗沙门菌。疫苗接种是一种很好的控制措施,本试验利用同源重组技术,敲除靶基因,并对nmpC基因进行了初步研究,为研制减毒活疫苗提供参考。本研究利用分子生物技术获得重组质粒pET-28a-nmpC,将其转化入表达菌株BL21经IPTG诱导,得到His-NmpC原核蛋白,经SDS-PAGE分析与Western blot验证,NmpC原核蛋白纯化后免疫小鼠对其免疫保护力及抗体水平进行Western blot鉴定和ELISA检测。结果显示,NmpC为包涵体表达且分子质量约为38kD,免疫印迹分析结果显示,NmpC原核蛋白可与His标签抗体和多抗血清特异性识别,说明NmpC蛋白具有良好的免疫原性,且对小鼠免疫保护力达到70%,是一个很好的疫苗靶点。利用λ-Red同源重组技术,将携带氯霉素敏感性的pKD3质粒对肠炎沙门菌基因组上的nmpC基因进行置换,通过PCR检测方法得出肠炎沙门菌nmpC基因缺失株（C50336ΔnmpC）;通过回补质粒pBR322对C50336ΔnmpC进行回补构建,利用免疫NmpC蛋白的血清为一抗Western blot验证得到结果,成功构建出肠炎沙门菌（C50336）nmpC基因缺失株（C50336ΔnmpC）及回补株。对肠炎沙门菌野生型、缺失株和回补株的生物学特性研究比较,结果表明,nmpC基因缺失对肠炎沙门菌的生长速率和生化特性无显著影响;nmpC基因参与调控肠炎沙门菌的运动能力、抗应激能力、生物被膜的形成能力及合成成分,该基因缺失后的肠炎沙门菌的各项能力均会减弱。对耐药性、毒力及免疫效果进行研究与分析,评估缺失株作为减毒苗的潜力。结果发现,缺失株对药物的耐药性都有所减少,毒力因子的含量有所降低,缺失株的致病力较野生型LD50升高了近20倍,毒力下降,免疫安全剂量缺失株对小鼠的保护率提高了20%,说明C50336ΔnmpC具有作为肠炎沙门菌减毒苗的潜力,给临床应用提供参考。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 沙门菌的概述
•   1.2 沙门菌抗原结构
•   1.3 沙门菌的毒力因子
•   1.4 OmpD/NmpC蛋白概述
•   1.5 沙门菌的OmpD/NmpC蛋白
•   1.6 λ-Red重组技术概述
•   1.7 研究的目的及意义
• 第二章 肠炎沙门菌NmpC蛋白原核表达及免疫保护力研究
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 试验菌株、质粒及动物
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 pET-28a-nmpC表达载体的构建
•     2.2.3 His-NmpC（rNmpC）蛋白的原核表达及验证
•     2.2.4 rNmpC蛋白的可溶性分析及纯化
•     2.2.5 多抗血清制备及识别rNmpC蛋白效果验证
•     2.2.6 免疫小鼠血清抗体水平的检测
•     2.2.7 rNmpC蛋白免疫保护试验
•   2.3 结果
•     2.3.1 nmpC基因的克隆
•     2.3.2 构建原核表达载体pET-28a-nmpC
•     2.3.3 rNmpC蛋白的原核表达及验证
•     2.3.4 rNmpC蛋白的表达形式鉴定及纯化
•     2.3.5 鼠源多抗血清对rNmpC蛋白识别效果验证
•     2.3.6 rNmpC蛋白免疫保护力试验
•     2.3.7 蛋白免疫小鼠血清抗体水平的检测结果
•   2.4 讨论与分析
•   2.5 小结
• 第三章 肠炎沙门菌nmpC基因缺失株的构建
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 试验菌株及质粒
•     3.1.2 主要试剂与酶
•     3.1.3 主要仪器设备
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 试验菌株及质粒的制备
•     3.2.2 λ-Red同源重组引物设计
•     3.2.3 扩增同源重组片段
•     3.2.4 肠炎沙门菌C50336感受态细胞的制备及pKD46转化
•     3.2.5 C50336/pKD46感受态的制备及电转化
•     3.2.6 pCP20质粒的介导抗性基因的敲除
•   3.3 回补株的构建
•     3.3.1 回补菌株表达载体pBR322-nmpC的构建
•     3.3.2 重组载体pBR322-nmpC的转化
•   3.4 检测基因缺失及回补效果
•   3.5 结果与分析
•     3.5.1 菌株的检测结果
•     3.5.2 缺失株及回补株的构建
•     3.5.3 用Western blot方法检测基因缺失及回补效果
•   3.6 讨论与分析
•   3.7 小结
• 第四章 肠炎沙门菌C50336ΔnmpC基因缺失株的生物学特性及毒力研究
•   4.1 试验材料
•     4.1.1 试验菌株
•     4.1.2 试验试剂
•     4.1.3 .主要仪器设备
•     4.1.4 常用试剂的配制
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 C50336ΔnmpC对生长速率的影响
•     4.2.2 C50336ΔnmpC对生化特性的影响
•     4.2.3 C50336ΔnmpC对运动能力的影响
•     4.2.4 C50336ΔnmpC对生物被膜的影响
•     4.2.5 RT-PCR检测nmpC基因缺失对肠炎沙门菌毒力因子的影响
•     4.2.6 C50336ΔnmpC对环境应激抵抗力的测定
•     4.2.7 C50336ΔnmpC对毒力的影响
•     4.2.9 西药药敏试验
•     4.2.10 中药抑菌试验
•     4.2.11 检测肠炎沙门菌C50336ΔnmpC基因缺失弱毒苗的保护率
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 C50336ΔnmpC对生长速率的影响
•     4.3.2 C50336ΔnmpC对生化特性的影响
•     4.3.3 C50336ΔnmpC对运动能力的影响
•     4.3.4 C50336ΔnmpC对生物被膜的影响
•     4.3.5 C50336ΔnmpC对生物被膜成分的结果
•     4.3.6 C50336ΔnmpC对毒力因子的影响
•     4.3.7 C50336ΔnmpC抵抗环境应激能力的结果
•     4.3.8 C50336ΔnmpC对毒力的影响
•     4.3.9 C50336ΔnmpC对耐药性的结果
•     4.3.10 C50336ΔnmpC对中草药体外抑菌的结果
•     4.3.11 减毒苗的保护试验结果
•   4.4 讨论与分析
•   4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苏硕青

导师: 史秋梅,李爱华

关键词: 肠炎沙门菌,原核表达,同源重组,基因缺失,减毒疫苗

来源: 河北科技师范学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河北科技师范学院

分类号: S852.61

总页数: 63

文件大小: 2538K

下载量: 143