苹果MdCYP716B1-like基因的克隆及功能分析

论文摘要

细胞色素P450是植物中家族成员最多的一类酶蛋白,在参与胁迫反应与植物的生物合成途径中发挥至关重要的作用。到目前为止,在水稻、拟南芥、烟草以及黑色三角叶杨等植物中有相关报道,目前关于苹果P450的功能报道很少,有许多的功能研究还不是很清楚。本研究从‘寒富’苹果中克隆出细胞色素P450 CYP716B1-like基因的全长,分别构建了其过表达载体与沉默载体,通过遗传转化得到了苹果转基因植株,并通过分析其转录组数据,获得许多差异表达的基因,为揭示苹果CYP716B1-like基因的功能奠定基础。主要结果如下:（1）利用RT-PCR技术从‘寒富’苹果中克隆出MdCYP716B1-like基因序列。亚细胞定位试验证明MdCYP716B1-like定位在叶绿体中。（2）利用qRT-PCR方法检测了‘寒富’二倍体苹果与其同源四倍体苹果不同组织器官中MdCYP716B1-like基因的相对表达量,在‘寒富’二倍体根中的表达量最高,茎、花、果相对次之,在叶中表达量最少;在其同源四倍体中,MdCYP716B1-like基因在果中的表达量最高,根与茎的表达量基本相同,在花与叶中表达量最低。（3）分析MdCYP716B1-like基因的启动子,发现含有响应激素的顺式作用元件,利用qRT-PCR方法检测到‘GL-3’中MdCYP716B1-like基因的表达水平受到ABA和MeJA不同程度的诱导。（4）分别构建了MdCYP716B1-like基因的过表达载体和沉默载体,并通过农杆菌介导的方法转化苹果‘GL-3’叶片,获得了4个过表达株系的转基因苹果与3个沉默株系的转基因苹果。（5）通过接种苹果炭疽菌,发现过表达MdCYP716B1-like基因的转基因苹果植株相较于野生型呈现更严重感病症状,沉默植株相较对野生型发病较轻,表明MdCYP716B1-like基因功能与植物-真菌互作有关。（6）对过表达MdCYP716B1-like的转基因植株与对照植株的转录组测序分析发现,大量差异表达基因集中在植物-病原互作途径、MAPK级联信号通路、植物激素转导途径和三萜类化合物合成途径,从中挑选JAR1、TIFY、PYL4、SAUR72、NPR1、TGA7、WRKY29、WRKY22、WRKY26、RPM1、PR1、SE3、SQS和OSC4等基因进行表达水平的qRT-PCR验证,其结果与转录组数据中表达量变化的趋势相同,进一步说明MdCYP716B1-like基因功能可能与植物免疫相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
•   1.1 植物抗病相关研究
•     1.1.1 植物抗病机制
•     1.1.2 植物免疫系统
•     1.1.3 植物信号转导
•   1.2 植物细胞色素P450 研究进展
•     1.2.1 细胞色素P450 命名与分类
•     1.2.2 细胞色素P450 的功能研究
•     1.2.3 CYP716 家族研究进展
•   1.3 转录组测序技术的发展与应用
•   1.4 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 试剂
•     2.1.3 培养基
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 植物核酸的提取与检测
•     2.2.2 基因的克隆与表达分析
•     2.2.3 亚细胞定位
•     2.2.4 苹果MdCYP716B1-like基因过表达载体构建
•     2.2.5 苹果MdCYP716B1-like基因RNAi干扰载体构建
•     2.2.6 农杆菌介导转化苹果‘GL-3’叶片
•     2.2.7 转基因植株的鉴定
•     2.2.8 在激素处理下MdCYP716B1-like基因的表达分析
•     2.2.9 文库的构建及转录组测序
•     2.2.10 差异基因片段的分析
•     2.2.11 转基因植株的抗病性检测
• 3 结果与分析
•   3.1 苹果MdCYP716B1-like基因的克隆与分析
•     3.1.1 苹果MdCYP716B1-like基因的克隆
•     3.1.2 MdCYP716B1-like的进化分析
•     3.1.3 MdCYP716B1-like氨基酸结构域分析
•   3.2 苹果MdCYP716B1-like基因的组织特异性表达
•   3.3 MdCYP716B1-like的亚细胞定位
•   3.4 MdCYP716B1-like启动子分析
•   3.5 苹果MdCYP716B1-like基因的遗传转化分析
•     3.5.1 苹果MdCYP716B1-like基因过表达载体构建及农杆菌转化
•     3.5.2 苹果MdCYP716B1-like基因RNAi载体构建及农杆菌转化
•     3.5.3 获得苹果转基因植株
•     3.5.4 苹果转基因植株的鉴定
•   3.6 MdCYP716B1-like在苹果中的功能验证
•     3.6.1 激素胁迫处理
•     3.6.2 苹果炭疽菌胁迫处理
•   3.7 过表达MdCYP716B1-like转基因苹果与‘GL-3’对照的转录组测序
•     3.7.1 测序质量评估
•     3.7.2 差异基因的分析
•     3.7.3 Gene Ontology功能显著性富集分析
•     3.7.4 KEGG通路显著富集分析
•     3.7.5 植物差异基因的筛选分析
•     3.7.6 差异基因的检测与验证
• 4 讨论
•   4.1 MdCYP716B1-like基因参与植物免疫
•   4.2 MdCYP716B1-like基因参与植物三萜类化合物合成
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王扬舒

导师: 马跃

关键词: 苹果,基因功能,转录组测序

来源: 沈阳农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 沈阳农业大学

分类号: S661.1;Q943.2

DOI: 10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000219

总页数: 72

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