新竹番茄曲叶病毒AV2功能研究

论文摘要

菜豆金黄花叶病毒（begomoviruses）在全球广泛分布,严重威胁番茄、木薯、棉花和烟草等经济或粮食作物的安全种植。研究begomovirus的基因功能,有助于深入认识begomovirus的危害机理,并为begomovirus相关病害的绿色防控提供理论支撑。按照基因组构成,begomovirus分为双组份begomovirus和单组份begomovirus。旧世界的双组份begomovirus普遍编码AV2蛋白。目前,研究者对AV2的基因功能还不够清楚。新竹番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Hsinchu virus,ToLCHsV）是广泛分布于我国南方的一种双组份begomovirus。本研究对ToLCHsV的AV2进行了功能解析,主要实验和结果如下:（1）AV2多克隆抗体的制备和AV2在寄主植物中的积累:将ToLCHsV AV2的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）克隆到PEASY?-Blunt E1载体,然后将重组子导入大肠杆菌BL21中,实现了AV2的原核表达;以原核表达所得的AV2蛋白免疫小鼠,获得了AV2蛋白的多克隆抗体;以所得抗体进行了Western Blot实验,发现AV2在ToLCHsV侵染的烟草和苎麻中都有积累。（2）AV2影响ToLCHsV侵染的反向遗传学研究:通过定点突变,构建了不能表达AV2的ToLCHsV突变体（ToLCHsV-ΔAV2）;以ToLCHsV-ΔAV2接种寄主植物,发现ToLCHsV-ΔAV2仍能侵染本氏烟（Nicotiana benthamiana）和普通烟（N.tabacum）,并造成严重症状。然而,在症状诱导时间上,ToLCHsV-ΔAV2比野生型ToLCHsV慢2天（本氏烟）或9天（普通烟）。在病毒积累水平上,ToLCHsV-ΔAV2也显著低于野生型ToLCHsV。（3）AV2对转录水平基因沉默（Transcriptional gene silencing,TGS）的抑制活性研究:将AV2的ORF构建到pGR107载体,获得表达AV2的重组马铃薯病毒X（Potato virus X,PVX）PVX-AV2;以PVX-AV2侵染16C-TGS本氏烟,发现异源表达的AV2能降低16C-TGS本氏烟中35S启动子的胞嘧啶甲基化水平,提升该启动子下游的GFP mRNA的表达,这表明AV2对TGS具有抑制活性。支持这一点的是,本研究通过重亚硫酸盐测序发现,ToLCHsV-ΔAV2基因组在本氏烟中的甲基化水平显著低于野生型ToLCHsV。（4）AV2对转录后基因沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS）抑制活性的研究:将AV2的ORF构建到了瞬时表达载体pEarlyGate100,获得pEarlyGate100-AV2;将pEarlyGate100-AV2以农杆菌注射的方式与一个表达GFP mRNA的二元载体（35S-GFP）共同导入16c本氏烟叶片,发现共表达AV2与GFP的区域在农杆菌注射后的第5天仍保持较强的GFP荧光,并伴有较高水平的GFP蛋白的积累（相较于阴性对照）,这表明AV2能抑制PTGS的发生。（5）AV2 TGS和PTGS抑制活性关键位点的鉴定:通过定点突变,构建了AV2突变体:AV2C89S（第89位的半胱氨酸变成丝氨酸）,将该突变体的ORF构建到pGR107和pEarlyGate100载体,研究了它的TGS和PTGS抑制子活性,发现AV2C89S丧失了TGS和PTGS抑制活性。（6）TGS和PTGS抑制活性对AV2功能发挥的重要性研究:通过定点突变,构建了表达AV2C89S的ToLCHsV;以ToLCHsV突变体分别接种普通烟和本氏烟,发现表达AV2C89S的ToLCHsV的突变体在侵染性上与ToLCHsV-ΔAV2相近。综上,本研究表明AV2对ToLCHsV不是必须的,但AV2能显著促进ToLCHsV对寄主植物的侵染。AV2功能的发挥与其TGS和PTGS抑制活性密切相关（影响AV2 TGS和PTGS抑制活性的C86S突变影响病毒的侵染性）。本研究加深了我们对ToLCHsV侵染机理的认识,也为进一步明确双组份begomovirus AV2的基因功能奠定了重要基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
•   1.1 双生病毒概述
•   1.2 Begomoviruses及其危害概况
•   1.3 begomovirus基因组结构
•   1.4 begomovirus与基因沉默
•   1.5 begomovirus AV2/V2 基因研究概况
•     1.5.1 单组份begomovirus V2 的功能研究
•     1.5.2 双组份begomovirus AV2 的功能研究
•   1.6 新竹番茄曲叶病毒简介
• 第二章 To LCHsV AV2 多克隆抗体的制备及其在寄主植物中的检测
•   2.1 材料
•     2.1.1 病毒、菌株和载体
•     2.1.2 主要试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 To LCHsV AV2 基因的克隆与原核表达载体的构建
•     2.2.2 目的基因表达
•     2.2.3 目的蛋白诱导
•     2.2.4 植物蛋白提取
•     2.2.5 SDS-PAGE以及Western Blot
•     2.2.6 To LCHsV AV2 多克隆抗体的制备与检测
•   2.3 结果
•     2.3.1 To LCHsV AV2 原核表达载体的构建及鉴定
•     2.3.2 To LCHsV AV2 原核载体的表达及多克隆抗体的获得
•     2.3.3 To LCHsV AV2 在寄主植物中的检测
•   2.4 小结
• 第三章 To LCHsV AV2 的反向遗传学研究
•   3.1 材料
•     3.1.1 病毒和实验植物
•     3.1.2 菌株
•     3.1.3 试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 基因的克隆和侵染性克隆载体的构建
•     3.2.2 重组质粒阳性克隆检测、转化农杆菌及接种植株
•     3.2.3 DNA的提取、检测及Southern Blot
•     3.2.4 蛋白的提取及Western Blot
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 To LCHsV-△AV2 侵染性克隆载体的构建及鉴定
•     3.3.2 To LCHsV与 To LCHsV-△AV2 侵染性比较
•     3.3.3 To LCHsV-AV2与To LCHsV-△AV2 接种植株后AV2 蛋白检测
•   3.4 小结
• 第四章 To LCHsV AV2 PTGS和 TGS抑制活性的鉴定
•   4.1 材料
•     4.1.1 病毒和试验植物
•     4.1.2 载体和菌株
•     4.1.3 试剂
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 基因的克隆及pEarleyGate-100 重组表达载体的构建
•     4.2.2 阳性克隆的重组质粒转化农杆菌感受态GV3101 及接种植株
•     4.2.3 快速法（蛋白酶抑制剂法）提取总蛋白及Western Blot
•     4.2.4 基因的克隆及PVX表达载体的构建
•     4.2.5 重组质粒、阳性克隆检测、转化农杆菌及注射植株
•     4.2.6 总RNA的提取、RT-PCR及荧光定量PCR
•     4.2.7 蛋白的提取、Western Blot及过氧化物检测
•     4.2.8 DNA的提取和DNA重亚硫酸氢盐测序
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 pEarleyGate-100 重组表达载体的构建
•     4.3.2 To LCHsV AV2为PTGS的沉默抑制子
•     4.3.3 PVX-AV2 的构建及鉴定
•     4.3.4 To LCHsV AV2为TGS的沉默抑制子
•     4.3.5 PVX-AV2 接种本氏烟症状及过氧化物检测
•     4.3.6 AV2对PVX积累的影响和其异源表达检测
•   4.4 小结
• 第五章 AV2的TGS和 PTGS抑制活性关键位点研究
•   5.1 材料
•     5.1.1 病毒和试验植物
•     5.1.2 载体和菌株
•     5.1.3 试剂
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 基因的克隆和侵染性克隆载体的构建
•     5.2.2 DNA的提取、检测及Southern Blot
•     5.2.3 蛋白提取、Western Blot和重亚硫酸氢盐测序
•     5.2.4 基因的克隆及Gateway重组表达载体的构建
•     5.2.5 pEarleyGate-100 重组表达载体转化农杆菌及接种植株
•     5.2.6 激光共聚焦显微镜观察
•     5.2.7 基因的克隆与PVX表达载体的构建
•     5.2.8 PVX表达载体转化农杆菌及接种植株
•     5.2.9 总RNA的提取、RT-PCR、荧光定量PCR及过氧化物检测
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 AV2（C89S）不抑制PTGS和 TGS
•     5.3.2 PVX-AV2C89S对 PVX的致病性与PVX-△AV2 相似
•     5.3.3 ToLCHsV-AV2C89S与 To LCHsV-△AV2 侵染性相似
•     5.3.4 AV2（C89S）不改变AV2 自身互作和亚细胞定位
•   5.4 小结
• 第六章 全文总结与讨论
•   6.1 总结
•   6.2 讨论
• 参考文献
• 附录 附录A 常用试剂及其缓冲液的配置
• 攻读硕士学位期间参与发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘顺民

导师: 吴祖建,杜振国

关键词: 菜豆金黄花叶病毒属,基因沉默抑制子,症状发展

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护

单位: 福建农林大学

分类号: S432.41

总页数: 84

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