导读:本文包含了定向分子进化论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:体外,分子,莽草,噬菌体,核苷酸,基因工程,丙酮。
定向分子进化论文文献综述
熊爱生[1]（2007）在《标记基因的克隆、化学合成和体外定向分子进化及其在果树基因工程中的应用研究》一文中研究指出标记基因是一种用来筛选和鉴定转化细胞、组织和转基因植株的DNA片段,包括起富集转化细胞作用的选择基因和易于检测表达产物的报告基因。抗生素类和抗除草剂类是当前转基因作物中采用的选择标记基因。目前常用的报告基因主要包括β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、荧光素酶基因(Luc)、绿色荧光蛋白基因(gfp)和冠瘿碱合成酶基因等。植物转基因中最广泛应用的报告基因是gus。转基因作物进入商业化生产阶段,其外源基因的逃逸是不可避免的。因此使用安全的标记基因和报告基因是一个很好的选择。体外定向分子进化是发现和改造生物活性分子的重要方法,提供了一种高效获得多样性的方法。DNA改组是重要的体外分子进化技术,结合高通量筛选在农业、环境污染治理、化学工业、基因治疗、疫苗、蛋白药物等方面有着广泛的应用。近年来,许多体外分子进化的新策略和新方法层出不穷。DNA改组技术的发展和成熟是在上世纪九十年代末期。特别是进入21世纪以来,体外分子进化技术在新技术和新理论的推动下,又得到了长足的发展。推理设计是基于基因和蛋白质信息进行基因和蛋白质序列的改造,作为基因和蛋白质体外快速改造有其重要的一面。化学法合成DNA是生物学基础研究和生物工程应用的一个非常重要的手段,化学法合成基因提供了一种改造基因,阐明基因功能,分析蛋白质-核酸相互作用的强有力手段,通过化学法合成和改造后能够实现高表达,也是消除多个点突变的好方法。近年来化学法合成DNA的发展使得大规模合成较长DNA序列成为可能。随着化学合成寡核苷酸链广泛的用于各类引物、基因全合成、DNA芯片等领域,实现了合成寡核苷酸链的小型化,自动化及高通量化。诞生了一些界面友好的设计基因软件。基因全合成自从出现后一直就有着广泛的应用,近年来应用的范围也越来越广泛。在重迭延伸PCR合成基因方法的基础上,建立了一种基于两步PCR的简单高效经济合成长DNA序列方法:PTDS。该方法主要涉及两步:首先通过12个长度60 nt且20 nt重迭的寡核苷酸,使用高保真的DNA聚合酶pfu合成4个长度为500 bp左右的的DNA片段;其次通过第一步PCR产物作为模板,使用最外侧的引物和高保真DNA聚合酶pyrobest进行第二步的PCR扩增,从而合成完整的目的抗虫基因vip3aI。另外进一步通过改良的PCR精确合成方法(PAS)合成了一编码普鲁兰酶的pulA基因和一编码耐高温β-葡萄糖苷酸酶的Tm-gus基因。大肠杆菌的β-葡萄糖苷酸酶基因,是一个使用广泛的报告基因。由于其具有检测灵敏,酶性质稳定,完善的酶学分析方法和可见的表型等特点,已经成为研究体外分子进化技术的一个好的模式。本文建立了一个高通量β-葡萄糖苷酸酶基因的体外分子进化体系,并通过该高通量体系获得了一个较野生型显着耐受高温的突变体:GUS-TR。该突变体的大肠杆菌转化子在膜上能够耐受100℃的高温达30分钟,而对照不能耐受70℃的高温。通过6-His表达和镍离子螯合层析得到纯化的突变体和野生型蛋白GUS-TR和GUS-WT。酶活性测定结果显示,经过70℃处理10分钟,表达的野生型的GUS-WT活性明显下降,而表达的耐高温的GUS-TR,经过80℃加热10分钟处理活性依然保留88%左右,经过80度加热30分钟,活性依然保留在50%以上。gus-tr基因序列测定分析共有15个核苷酸位点发生改变,导致了12个氨基酸位点发生突变,分别是:I149T,N181S,D436E,V446A,A451V,Q493R,T509A,M532T,N550S,G559S,N566S和M591I。以gus-tr基因为模板进一步使用定点突变结合耐高温性状分析,发现存在于定点突变个体GUS-TR中的六个突变位点(Q493R,T509A,M532T,N550S,G559S和N566S)对于耐高温性的获得是重要的,且存在关联效应。其中Q493R和T509A位点是两个新发现的耐高温β-葡萄糖苷酸酶关键位点。通过定点突变技术获得含有上述六个关键位点的突变个体GUS-TR3337。通过对突变个体GUS-TR3337和野生型大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶(GUS-WT)的蛋白质纯化后分析,野生型蛋白质在70℃处理10分钟后酶活性完全丧失。而突变体GUS-TR3337在80℃处理10分钟后酶活性保留在75%以上。进一步通过蛋白质模型分析研究了耐高温突变个体和野生型之间的关系,从分子机制上探讨了β-葡萄糖苷酸酶之结构和功能的关系。为了直观地证明获得的耐高温β-葡萄糖苷酸酶突变体在植物转基因中作为报告基因的可行性,将获得的突变基因gus-tr3337和来自大肠杆菌的野生型gus基因分别转入拟南芥植株中进行植物中耐高温性能研究。通过农杆菌蘸花法分别获得多个转基因株系,编号分别为YG8557(耐高温GUS基因gus-tr3337)和YG8555(野生型GUS基因gus-wt)。通过对转基因YG8557拟南芥植株和YG8555拟南芥植株进行了高温处理后X-Gluc染色的实验发现,野生型GUS基因(gus-wt)转基因拟南芥未经高温处理显色良好,呈现蓝色。而经过60℃处理5分钟时略微显蓝色,且非常微弱,随着处理温度的升高和处理时间的延长,转基因植株均不能显蓝色。而耐高温改组GUS基因(gus-tr3337)转基因拟南芥植株未经高温处理显色良好,呈现蓝色。经过60℃处理20分钟、30分钟;70℃处理10分钟、20分钟、30分钟;80℃处理10分钟、20分钟很好的显蓝色。甚至80℃处理30分钟仍能够较明显的显示蓝色,说明经过体外定向分子进化技术改组突变的耐高温β-葡萄糖苷酸酶(GUS-TR3337)在植物中依然能够保持耐高温性能。通过RACE技术从苹果中克隆了一个编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因(mdepsps),多重序列比对分析发现苹果来源的EPSPS与蒺藜苜蓿的EPSPS关系最近。将mdepsps基因构建入原核表达载体pYPX251中,发现含有该表达质粒的大肠杆菌菌株不能够在含有30 mM的草甘膦的M9培养基正常生长。通过体外定向分子进化技术对mdepsps进行了改造,获得了在M9培养基上添加50 mM的草甘膦仍能正常生长的阳性克隆15个。本文从果树基因工程研究中广泛使用的报告基因(β-葡萄糖苷酸酶)和有潜在应用前景的选择标记基因(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)两方面入手,分别通过基因分离、设计、化学合成、体外定向分子进化等手段进行研究。通过化学合成和体外定向分子进化获得的耐高温的β-葡萄糖苷酸酶可以作为新型报告基因在果树基因工程中应用,尤其是一些具有较高内源GUS的果树物种。从苹果中克隆并通过改组提高功能的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因具有:来源于苹果,安全可靠,功能良好等特点,且具有自主知识产权,有较强的理论和实际意义。上述研究丰富了果树基因工程中的报告基因种类,对果树遗传转化有一定的意义,同时也进一步丰富了果树基因工程中的基因来源,尤其是安全性的来源果树本身的基因,为果树基因工程应用奠定基础。(本文来源于《南京农业大学》期刊2007-11-01）
熊爱生,章镇,姚泉洪,彭日荷,庄静[2]（2006）在《酶体外定向分子进化技术:环境生物污染治理中的新星》一文中研究指出环境生物技术在环境控制与污染治理中的应用主要是利用微生物降解和转换污染物。一些人类合成的化学物质由于具有高毒性,且难以被自然界微生物降解,已经严重威胁生态环境和人类的健康。生物治理以其低成本、完成矿质化和实现原位处理等特点,成为较好的治理技术。体外定向分子进化技术是一种发现新的生物表型和新酶的好方法,DNA改组是重要的体外分子进化技术,成功地改造了许多在医药、工业和环境保护等的商业酶。综述了近年来体外定向分子进化技术在环境生物污染治理中的研究进展和应用。(本文来源于《环境污染与防治》期刊2006年11期）
熊爱生,姚泉洪,章镇,彭日荷,庄静[3]（2005）在《体外定向分子进化的新策略及新应用》一文中研究指出体外定向分子进化是发现和改造生物活性分子的重要方法,提供了一种高效的获得多样性的方法。DNA改组(DNA shuffling)是重要的体外分子进化技术,结合高通量筛选能够改造许多重要的医药、工业、环境保护等方面的商业酶。近年来,许多体外分子进化的新策略和新方法层出不穷,得到了良好的发展和应用,其中有代表性的11种是DNA家族改组(DNA family shuffling),部分基因片段改组、单链DNA家族改组(SSDNAs)、简并引物基因改组(DOGS)、基因组改组(Genome Shuffling)、瞬时模板的随机嵌合(RACHITT)、单向引物的随机重组(MURA)、自我复制(CSR)改组、易错环行扩增(error-prone RCA)、基于遗传密码随机切除(COBARDE)、核酸内切酶V(endonuclease V)替代核酸内切酶DNaseI等。(本文来源于《科学技术与工程》期刊2005年24期）
熊爱生,姚泉洪,章镇,彭日荷,庄静[4]（2005）在《基因体外定向分子进化技术在农业中应用的研究进展》一文中研究指出农业生物工程在农业生产中发挥着重要的作用,已经在除草剂抗性,抗虫,抗病和饲料添加剂 等方面取得了良好的成绩。体外定向分子进化技术是改造基因的有效手段,通常可以用来提高酶的比 活,改变酶动力学特征,产生新的底物特异性,产生新的产物和改变酶的最适条件。该技术已经成功的 应用在农业的各个领域。主要从除草剂抗性,抗虫,抗病和饲料添加剂4个方面对基因体外定向分子 进化技术在农业中的应用作一综述。(本文来源于《中国农学通报》期刊2005年12期）
柯涛,马向东,陈明洁,汪越胜,何光源[5]（2005）在《核苷酸类似物应用于定向分子进化的研究》一文中研究指出核苷酸类似物具有能与天然DNA/RNA中的相应碱基配对的特性,因而在核酸的分子进化及其结构和功能研究领域中具有独特的作用。近年来,核苷酸类似物在迅速发展的定向进化研究领域中,如易错PCR、重组突变以及饱和诱变等技术中,有了越来越多的应用并已取得了许多重要的成果。该文介绍应用核苷酸类似物的一些定向进化技术;核苷酸类似物对进化理论研究的贡献及其发展前景。(本文来源于《生命的化学》期刊2005年03期）
张今,李爽,李宾,孙妍红[6]（2004）在《进化生物技术——酶定向分子进化》一文中研究指出定向分子进化 (directedmolecularevolution)又称实验室进化 (laboratoryevolution)或进化生物技术(evolutionarybiotechnology)。它旨在体外模拟自然进化机制 (突变、重组和选择 ) ,使进化过程朝着人们需要的方向发展。定向分子进化的实质是达尔文进化论思想在分子水平上的延伸和应用。用进化和组合技术研究和解决复杂生物学和化学问题已成为化学和生物学迅猛发展的领域之一。(本文来源于《医学分子生物学杂志》期刊2004年06期）
程巨龙[7]（2002）在《采用定向分子进化方法构建改形抗CD28重链单域抗体及抗人卵巢癌叁特异抗体的构建与表达》一文中研究指出本研究的第一个目的是验证一种具有实际意义，简化易行构建改形抗体的新方法。与以往其它方法不同的是：该方法采用实验定向分子进化方法，不需要对抗体序列进行空间模拟，以确定人源抗体受体的FRs以及受体FRs上的哪个氨基酸残基需要进一步突变；该改形方法将抗体的改形及亲和力成熟于同一步骤完成，从而节省构建的时间及劳动强度。利用该方法构建了改形抗CD28重链单域抗体。根据鼠源抗CD28VH氨基酸序列，从GenBank中得到两个与该序列最同源的人源抗体，选用其中之一作为改形抗体的主框架FRs区。在保留鼠源CDRs氨基酸残基的同时，对主框架FRs一些氨基酸残基进行可选择替换突变，可选择替换原则根据对原始鼠源序列；鼠源抗体所在Kabat分类中的种属序列；两个人源抗体序列及人源抗体所在Kabat分类中的种属序列的比较而确定。选择大肠杆菌喜好密码子，推导出其基因序列；合成大小不同的核苷酸片段，采用重迭PCR扩增得到改形抗体全长基因。在合成片段时，将突变位点要被替换氨基酸残基和替换氨基酸残基的核苷酸采用简并合成，使二者都有机会在完整基因中出现。为了进一步提高改形抗体基因数目，在重迭PCR扩增改形抗体全长基因时，采用高浓度Mg~(2+)和Taq DNA聚合酶，以便进一步随机引入突变。利用PCR产物构建了一个改形抗CD28VH抗体库，经过叁轮淘选，获得了具有高结合活性的改形抗体基因。进一步将两个改形基因与c-myc及人IgG3'CL铰链区基因融合在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，复性后的融合表达蛋白仍表现为具有较高与CD28分子的结合活性。这一结果表明，该构建改形抗体方法是有效和可行的，通过一步就可以获得满意的改形抗体。 本研究第二个目的是构建及表达一种新的叁特异抗体：抗人卵巢癌scFv×改形抗CD3 scFv×改形抗CD28VH。构建的叁特异抗体有两种类型：环形叁特异抗体；非环形叁特异抗体。在叁特异抗体构建中使用了不同的连接肽序列(interlinker)，这些序列的使用，引入了一些不同的生物学功能。两种类型的叁博土论文 中文摘要特异抗体的基因在大肠杆菌BLZI pE3）中表达后，测定了表达蛋白与CD28分子的结合活性。(本文来源于《沈阳药科大学》期刊2002-05-01）
定向分子进化论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
环境生物技术在环境控制与污染治理中的应用主要是利用微生物降解和转换污染物。一些人类合成的化学物质由于具有高毒性,且难以被自然界微生物降解,已经严重威胁生态环境和人类的健康。生物治理以其低成本、完成矿质化和实现原位处理等特点,成为较好的治理技术。体外定向分子进化技术是一种发现新的生物表型和新酶的好方法,DNA改组是重要的体外分子进化技术,成功地改造了许多在医药、工业和环境保护等的商业酶。综述了近年来体外定向分子进化技术在环境生物污染治理中的研究进展和应用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
定向分子进化论文参考文献
[1].熊爱生.标记基因的克隆、化学合成和体外定向分子进化及其在果树基因工程中的应用研究[D].南京农业大学.2007
[2].熊爱生,章镇,姚泉洪,彭日荷,庄静.酶体外定向分子进化技术:环境生物污染治理中的新星[J].环境污染与防治.2006
[3].熊爱生,姚泉洪,章镇,彭日荷,庄静.体外定向分子进化的新策略及新应用[J].科学技术与工程.2005
[4].熊爱生,姚泉洪,章镇,彭日荷,庄静.基因体外定向分子进化技术在农业中应用的研究进展[J].中国农学通报.2005
[5].柯涛,马向东,陈明洁,汪越胜,何光源.核苷酸类似物应用于定向分子进化的研究[J].生命的化学.2005
[6].张今,李爽,李宾,孙妍红.进化生物技术——酶定向分子进化[J].医学分子生物学杂志.2004
[7].程巨龙.采用定向分子进化方法构建改形抗CD28重链单域抗体及抗人卵巢癌叁特异抗体的构建与表达[D].沈阳药科大学.2002
论文知识图
