睾丸酮丛毛单胞菌中多种蛋白与SDRx的生物学作用

论文摘要

睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)是一种能够降解类固醇的革兰氏阴性细菌,其代谢过程有20几种酶共同参与,近年关于睾丸酮丛毛单胞菌的生物修复作用及酶基因表达调控成为很多学者关注热点。SDRx短链脱氢酶是睾丸酮丛毛单胞菌中一种重要的激素降解酶。本文通过重组质粒的构建、酶联免疫吸附、高效液相色谱、质粒共转化等方法研究睾丸酮丛毛单胞菌中三种调控蛋白(LysR、LuxR、TetR)对SDR的生物学作用。通过构建SDRx基因蛋白表达载体;利用大肠杆菌BL21(DE3)plysS菌株进行原核表达并纯化目的蛋白;利用纯化的蛋白制备小鼠多克隆抗体,利用ELISA的检测方法测定抗体效价并绘制标准曲线;利用基因同源重组及移码突变的原理构建睾丸酮丛毛单胞菌SDRx基因敲除突变株,并利用HPLC检测其在五种不同激素培养条件下,LB培养基中所剩余激素含量;将含有三种调控蛋白的重组质粒与含有107启动子的SDRx重组质粒共转化到HB101菌株中,加激素诱导并提取共转化菌株总蛋白,利用ELISA的方法检测共转化菌株中SDRx的表达量。实验结果表明:成功克隆了SDRx基因并表达及纯化了SDRx蛋白,检测蛋白浓度达116.66μg/mL;成功制备效价较高的SDRx小鼠多克隆抗体,效价达到1:8000;SDRx基因影响睾丸酮丛毛单胞菌对激素的分解能力,其影响程度睾丸酮>孕酮>甲睾酮>雌酮>雌二醇;在睾丸酮丛毛单胞菌中LysR调控蛋白对SDRx脱氢酶几乎无作用。LuxR和TetR调控蛋白对SDRx脱氢酶起抑制作用,其中孕酮诱导的条件下TetR调控蛋白的抑制作用更强,是LuxR调控蛋白的一倍。本文的实验结果为睾丸酮丛毛单胞菌在自然界中类固醇激素的生物降解及基因调控研究提供实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 国内外研究进展
•   1.3 研究目的及意义
•   1.4 研究方案
• 第二章 SDRx脱氢酶基因克隆及表达载体构建
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 仪器及药品
•     2.1.3 试剂及溶液
•   2.2 实验内容
•     2.2.1 睾丸酮丛毛单胞菌菌种复苏
•     2.2.2 引物的设计与合成
•     2.2.3 睾丸酮丛毛单胞菌基因组DNA的提取
•     2.2.4 睾丸酮丛毛单胞菌中SDRx基因的克隆
•     2.2.5 pMD18-T-SDRx重组质粒的构建
•     2.2.6 pET-15b-SDRx重组质粒的构建
•   2.3 结果
•     2.3.1 目的基因的获取
•     2.3.2 连接pMD18-T载体鉴定
•     2.3.3 pMD18-T-SDRx重组质粒测序结果
•     2.3.4 pET-15b-SDRx重组质粒鉴定
•     2.3.5 pET-15b-SDRx重组质粒测序结果
•   2.4 结果讨论
• 第三章 重组SDRx脱氢酶的表达及纯化
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 主要仪器及药品
•     3.1.2 主要试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 SDRx重组蛋白的诱导及表达
•     3.2.2 SDRx重组蛋白的纯化及鉴定
•   3.3 结果
•     3.3.1 重组载体p ET-15b-SDRx转入表达菌种
•     3.3.2 IPTG诱导工程菌表达
•     3.3.3 蛋白含量检测
•   3.4 结果与讨论
• 第四章 SDRx蛋白多克隆抗体的制备及效价测定
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 主要仪器及药品
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 小鼠多克隆抗体的制备
•     4.2.2 抗体效价的测定
•     4.2.3 ELISA标准曲线的建立
•   4.3 结果
•     4.3.1 多克隆抗体效价
•     4.3.2 ELISA标准曲线的建立
•   4.4 结果讨论
• 第五章 构建SDRx敲除菌株并研究其生理活性
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 主要仪器
•     5.1.2 主要试剂
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 引物的设计与合成
•     5.2.2 SDRx基因同源重组片段的PCR扩增
•     5.2.3 PCR产物的鉴定
•     5.2.4 重组载体p MD18-T-SDRx300 的构建
•     5.2.5 重组载体p CR2.1-TOPO-SDR300 的构建
•     5.2.6 SDRx降解激素的功能表征
•     5.2.7 LB培养基中甾体激素残留量的HPLC分析
•   5.3 结果
•     5.3.1 目的基因的获取
•     5.3.2 pCR2.1-TOPO-MSDRx重组质粒的构建
•     5.3.3 睾丸酮丛毛单胞菌SDRx敲除株PCR验证
•     5.3.4 HPLC检测甾体激素残留量结果
•   5.4 结果讨论
• 第六章 三种蛋白对SDRx脱氢酶调控作用的研究
•   6.1 实验材料
•   6.2 实验内容
•     6.2.1 目的基因的克隆
•     6.2.2 pMD18-T-107SDRx/LysR/TetR重组质粒的构建
•     6.2.3 pK18-107SDRx,pUC19-LysR/TetR重组质粒的构建
•     6.2.4 pK18-107SDRx分别与pUC19-LysR/LuxR/TetR质粒共转化
•     6.2.5 共转化菌株的诱导表达及总蛋白的提取
•     6.2.6 间接法ELISA检测共转化菌株总蛋白中SDRx脱氢酶含量
•   6.3 结果
•     6.3.1 目的基因的获取
•     6.3.2 pMD18-T-TetR/LysR/107SDRx重组载体的鉴定
•     6.3.3 pMD18-T-TetR/LysR/107SDRx双酶切鉴定
•     6.3.4 pK18-107SDRx,pUC19-LysR/LuxR/TetR重组质粒鉴定
•     6.3.5 测序结果
•     6.3.6 质粒共转化及ELISA方法鉴定
•   6.4 结果讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙基丰

导师: 于源华

关键词: 睾丸酮丛毛单胞菌,脱氢酶,基因调控

来源: 长春理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 长春理工大学

分类号: Q936

总页数: 69

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