野生褐家鼠体内病毒群落解析及新发病毒鉴定

论文摘要

众所周知,微生物是包括细菌、真菌和病毒等在内的一大类生物群体,是人体不可或缺的一部分。其中,病毒是一种能感染生物体并容易在动物和人之间传播的微生物。近年来,由新的流行性病毒感染导致的病毒性疾病频繁发生,严重威胁着人类健康和生命财产安全。动物总是与人类有着密切的关系,而啮齿动物约占所有哺乳动物种类的43%,分布广泛。许多啮齿动物的饮食是混合的,但有些啮齿动物主要以种子或绿色植物为食。现已知60多种人类传染病病毒是由啮齿动物携带的,这些啮齿动物与人类生活密切相关,并且它们的尿液、粪便及其体表寄生虫（如蜱、螨和跳蚤）提供了许多跨物种病毒传播的机会。传统的病毒检测方法在检测新病毒和未知病毒方面有较大的局限性,基于第二代测序技术的病毒基因组学解决了这个问题。本研究方法直接以样本中存在的所有病毒核酸序列为研究对象,对样本中已知和未知病毒有较好的检测效果,这项技术的出现和兴起,为新病毒的挖掘和新发传染病的预警提供了强有力的技术支持。为了探索野生大鼠病毒群落的组成,探索新型潜在的致病性病毒,本研究采用病毒基因组学方法,对野生大鼠粪便、血液、口腔拭子、皮肤拭子及脑、肺、肝组织中的病毒群落进行了研究。结果野生大鼠不同样本病毒群落的组成镇江市野生大鼠血液标本中病毒群落组成差异较大,共检测到约40种不同科的病毒,其中Anelloviridae 45.29%,Parvoviridae 29.63%,Secoviridae 7.78%,Retroviridae 4.35%,Flaviviridae 3.53%,Virgaviridae 1.32%,Microviridae 0.90%以及其他使野鼠血液病毒化的病毒。对野生大鼠脑病毒群落的分析表明,野生大鼠脑病毒群落的组成具有多样性。在所有病毒中,Retroviruses所占比例最大,达45.60%,构成了野生大鼠病毒群落的主体,其次为Reoviridae 9.69%,Anelloviridae 9.45%,Microviridae 7.15%,Poxviridae 6.11%。实验结果表明,野生大鼠粪便中病毒群落的组成包括80个不同科的病毒,其中也有能引起动物和人类严重感染的病毒,包括一些昆虫和植物病毒。在野生大鼠肝脏标本中发现了病毒的变异,有来自不同科的病毒,包括:Parvoviridae、Retroviridae、Anelloviridae、Phycodnaviridae、Hepeviridae、Herpesviridae、Mimiviridae、Poxviridae、Asfaviridae、Baculoviridae和Iridoviridae。野生大鼠肺样本包括了来自大约55个不同病毒家族的病毒,其中有63.40%的病毒属于Retroviruses,6.32%属于Poxviridae,3.60%属于Anelloviridae。野生大鼠口腔和皮肤拭子病毒群落多样性研究表明,有来自Picobirnaviridae和Parvoviridae的病毒,也有来自Bunyaviridae和Hepeviridae的病毒,在皮肤拭子标本中发现的主要是昆虫和植物病毒。而在野生大鼠皮肤和口腔拭子中,我们还发现了一些新的Papillomaviridae病毒。野生大鼠样本中新病毒的鉴定在本研究中,测序使用具有250个碱基配对末端的Illumina Mi Seq,从140个样品提取的核酸中产生了总共10,329,088个独特的读数并进行了测序。将来自每个样品的序列读数从头组装到不同长度的重叠群中。然后将contigs和singlet进行分类,并使用BLASTx将其与Gen Bank非冗余数据库进行比较（E评分,10-5）。细小病毒科（Parvoviridae）是由长度为4-6kb的线性单链DNA（ss DNA）基因组编码的小的、有弹性的无包膜病毒,具有两个ORF。细小病毒科的病毒可以感染啮齿动物,或者在家养动物中显示出垂直传播的潜力。犬微小病毒、猫细小病毒和猪细小病毒可在自然感染的宿主物种中引起宫内或胎盘感染。我们从野生大鼠的不同样品中鉴定了丰富的序列,显示出与细小病毒科的相似之处。这些序列被命名为Wr Pv。约7份粪便样本,3份口腔拭子,2份血液和2份肝脏样品为细小病毒样序列阳性。对序列进行从头组装和比对。用Gen Bank中最匹配的BLASTx结果构建系统发育树。基于系统发育树结果和遗传距离计算,我们的数据中的序列与其他已识别的细小病毒科物种有显着关联。我们检测到一些属于腺病毒（ADV）的序列读取。来自不同野鼠样本的ADV。我们将这些序列命名为Wr Adv。最小的核苷酸为1220bp,最大的核苷酸为1590bp。序列读数与其在Gen Bank中BLASTx之后的最佳匹配野鼠Ad V2的核苷酸相似性高达76.18%。成功构建了基于Hexon蛋白的系统发育树。然而,结果显示,我们文库中的Wr Adv序列在野鼠ADV和鼠腺病毒2之间产生了分支。在本研究中,几乎每一份野鼠粪便样品中的小RNA病毒（PBV）相关序列都呈阳性,这是野鼠粪便样品中哺乳动物类病毒序列的最高流行率和数量。来自名为Wr PBVs的文库的序列。此外,来自野生大鼠的样本还含有组装的序列读数,其氨基酸序列显示与来自Astroviridae的病毒相同。序列的比对允许使用四个具有代表性的最佳BLASTx结果构建系统发育树。结果表明,来自野鼠样本的病毒序列正在形成单独的分支。圆环病毒科分为圆环病毒和圆环病毒两个属,该科病毒圆形,无包膜,单链环状DNA（Ss DNA）。圆环病毒能传播并高度流行,这些病毒与各种感染有关,特别是在猪的皮炎、生殖疾病、胃肠炎和呼吸系统疾病中,以及在禽类感染中如鹦鹉热喙病、羽毛病和鸡贫血。我们样本中的圆环病毒科被命名为Wr CV,2个圆环病毒相关基因组均来自粪便样品。将本研究中鉴定的圆环病毒及其基于Gen Bank中Rep的最佳BLASTx匹配的序列进行系统发育分析。Cardiovirus是一个隶属于Picornaviridae的病毒属。人和动物是其自然宿主,可引起严重疾病。我们利用病毒基因组学,发现了一种新的Cardiovirus。从制备样本开始,分离核酸,构建文库,并采用基于Mi Seq Illumina平台进行测序的方法,利用BLASTx重新组装独特的读取数据,并与Gen Bank中非冗余蛋白质数据库进行比较,采用聚合酶链反应（PCR）对不同样本中的新病毒进行了筛选鉴定。随后采用反向PCR技术建立了新病毒的全基因组,最后从一只野生大鼠粪便中鉴定出一种新的Cardiovirus,命名为amzj-2018。新病毒的基因组全长为8186 bp,只有一个ORF,编码了2292个氨基酸的多蛋白。amzj-2018的基因组与其他cardioviruses具有相似的特征,基于多蛋白全氨基酸序列的系统发育分析表明,amzj-2018在Saffold virus（SAFV）和大鼠1型（RTV-1）之间形成了一个独立的分支。基于多蛋白不同区域（分别包括P1、P2、P3和P2+P3）的系统发育分析显示了不一致树,其中基于P3区域的树表明amzj-2018分别聚集在Theiler’s Murine Encephalomyelitis Virus（TMEV）和RTV-1之间。PCR筛选结果表明该病毒株仅存在于20份野生大鼠粪便中的一份。结论（1）使用病毒基因组学,我们掌握了野生病毒群落的组成;（2）野生大鼠的血液、脑、动物、肝脏、肺、口腔拭子和皮肤拭子病毒群落的组成。（3）在野生大鼠的粪便中发现了新的Cardiovirus。

论文目录

• 摘要
• abstract
• Chapter1 Introduction and Literature Review
•   1.1 Background
•   1.2 Virome
•     1.2.1 Eukaryotic virome a factor for health and disease
•     1.2.2 Gut virome and its composition in animals
•     1.2.3 Enteric viruses and their impact on animal health
•     1.2.4 Virome in wild rats（Rattus Novergicus）
•   1.3 Viral metagenomics
•   1.4 Applications of Viral Metagenomics
•   1.5 Research Method of Viral Metagenomics
•     1.5.1 Sample Handling
•     1.5.2 DNA Library Construction
•     1.5.3 DNA Sequencing library
•     1.5.4 Library sequencing analysis results
•     1.5.5 Metagenomics research status and development trend of the virus
•   1.6 Research purpose and significance
•     1.6.1 Complete route of this study
• Chapter2 Material and Methods
•   2.1 Materials and Methods
•   2.2 Laboratory Reagents its Supplier Name Used in Study
•   2.3 Methodology
•     2.3.1 Sample size and source
•     2.3.2 Sample collection and storage
•     2.3.3 Sample design
•   2.4 Viral Metagenomics approach
•     2.4.1 Filtration
•     2.4.2 Extraction of viral RNA by QiaAmp（Qiagen）
•     2.4.3 Random amplification
•   2.5 Nextera XT DNA Library Prep by MiSeq
•     2.5.1 Construction of high-throughput sequencing library
•     2.5.2 Library expansion increase
•     2.5.3 Purification of Library
•     2.5.4 Library DNA Fragment length screening
•     2.5.5 Detection quality of virus library
•     2.5.6 Libraries MiSeq Deep sequencing
•     2.5.7 Library sequencing results and Bioinformatics Analysis
•   2.6 Metagenomics analysis of Viruses from wild rat Samples
•     2.6.1 Getting information about viral genome or part of the sequence
•   2.7 Extraction of viral nucleic acid from positive samples
•     2.7.1 Screening primer design and PCR positive sample detection
•     2.7.2 PCR detection of positive samples
•   2.8 Phylogenetic analysis
• Chapter3 Experimental Results
•   3.1 Overview of wild rat Virome
•     3.1.1 Pool1
•     3.1.2 Pool2
•     3.1.4 Pool3
•     3.1.5 Pool4
•     3.1.6 Pool5
•     3.1.7 Pool6
•     3.1.8 Pool7
•   3.2 Anelloviruses in wild rats
•   3.3 Adenoviruses in wild rats
•   3.4 Picobirnaviruses in wild rats
•   3.5 Parvoviruses in wild rats
•   3.6 Astroviruses in wild rats
•   3.7 Members of Genomoviridae and Circo like virus in wild rats
•   3.8 Plants and Insects viruses
•   3.9 Picornaviridae
• Chapter4 Observation and Discussion
• Chapter5 Conclusion and Policy Implication
• References
• Acknowledgements
• PUBLICATIONS

文章来源

类型: 博士论文

作者: Asif Mahmood

导师: 张文

关键词: 病毒基因组学,高通量序列,系统发育分析

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江苏大学

基金: National Key Research and Development Programs of China No. 2017YFC1200201,Jiangsu Provincial Key Research and Development Projects No.BE2017693,National Natural Science Foundation of China No. 81741062

分类号: Q939.4

DOI: 10.27170/d.cnki.gjsuu.2019.000127

总页数: 130

文件大小: 2659K

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