海洋沉积物中琼胶酶基因的表达及其在制备新琼二糖中的应用

论文摘要

琼胶酶是一类能够降解琼胶生成琼胶寡糖的糖苷水解酶。琼脂寡糖具有多种生理和生物学特性,并且在食品、化妆品和医疗等领域具有潜在的应用价值。利用琼胶酶降解琼胶来制备一系列聚合度不同的琼胶寡糖,被认为是最理想的绿色生产技术。因此,筛选高效产琼胶酶的菌株、挖掘酶学性质优良的琼胶酶以及制备琼胶寡糖都具有重要的实际意义。海洋沉积物中蕴藏着非常丰富的微生物资源,本文分别从近海和深海来源的沉积物中挖掘琼胶酶基因,并建立了以龙须菜为原料制备新琼二糖的技术,主要研究内容及结果如下:(1)自红树林沉积物微生物宏基因组中预测到一条编码氨基酸序列相似性为58.64%的琼胶酶基因agaM1,并利用枯草芽孢杆菌进行胞外表达。重组AgaM1(Recombinant AgaM1,rAgaM1)的最适温度为50°C,最适pH为7.0。rAgaM1具有良好的热稳定性,此外,rAgaM1能够降解龙须菜,产生新琼六糖和新琼四糖;(2)在前期研究中对分离自西太平洋深海沉积物的新种太平洋火色杆菌Flammeovirga pacifica WPAGA1进行了基因组测序,并对与琼脂糖代谢相关酶的基因进行了预测和分析。本文主要针对菌株WPAGA1中唯一的GH50家族的琼胶酶基因aga2660进行深入分析。将琼胶酶基因aga2660克隆并转化到E.coli BL21(DE3)中表达并纯化。结果表明,重组Aga2660(Recombiant Aga2660,rAga2660)与其他GH50家族的琼胶酶不同,可以将低聚合度的新琼寡糖降解为新琼二糖,但是不能作用于大分子琼胶的降解。rAga2660最适温度为30°C,且具有良好的热稳定性,表明该酶在新琼二糖的工业生产中具有较大的应用潜力。(3)以龙须菜为原料,利用rAgaM1和rAga2660联合制备新琼二糖,通过细胞毒性检测和美白功效评估,结果表明,与新琼四、六糖相比,新琼二糖作用于细胞上的安全性大大提高,且新琼二糖的美白功效优于新琼四糖和新琼六糖,表明rAgaM1和rAga2660联用的技术具有较好的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 红树林生境
•     1.1.1 红树林生态系统
•     1.1.2 红树林沉积物中微生物多样性
•   1.2 深海微生物资源概况
•     1.2.1 深海微生物及其多样性
•     1.2.2 深海沉积物微生物资源研究进展
•     1.2.3 菌株Flammeovirga pacifica WPAGA1介绍
•   1.3 琼胶与琼胶酶
•     1.3.1 琼胶
•     1.3.2 琼胶酶的分类
•     1.3.3 琼胶酶的应用
•     1.3.4 琼胶酶的研究进展
•   1.4 琼胶寡糖
•   1.5 本论文的研究思路、目的与意义
• 2 红树林沉积物中重组琼胶酶rAgaM1的克隆表达、酶学性质及酶解产物分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 培养基
•     2.1.4 仪器设备
•     2.1.5 琼胶酶基因agaM1的序列分析
•     2.1.6 琼胶酶基因agaM1的克隆表达及重组质粒的构建
•     2.1.7 rAgaM1的胞外诱导表达
•     2.1.8 rAgaM1诱导表达条件的优化
•     2.1.9 rAgaM1的SDS-PAGE及活性染色
•     2.1.10 rAgaM1酶活力测定
•     2.1.11 rAgaM1最适温度及最适p H的测定
•     2.1.12 重组质粒稳定性的测定
•     2.1.13 利用龙须菜生产琼胶寡糖及酶解产物分析
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 琼胶酶基因agaM1的序列分析
•     2.2.2 琼胶酶基因agaM1的克隆表达
•     2.2.3 rAgaM1的SDS-PAGE及活性染色结果
•     2.2.4 rAgaM1诱导表达条件的优化结果
•     2.2.5 rAgaM1酶活力
•     2.2.6 rAgaM1最适温度及最适p H
•     2.2.7 重组质粒的稳定性
•     2.2.8 rAgaM1的酶解产物分析
•   2.3 讨论
• 3 WPAGA1菌株中琼胶酶基因aga2660克隆表达、酶学性质分析及降解产物的研究
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 菌株和质粒
•     3.1.2 实验试剂
•     3.1.3 培养基
•     3.1.4 仪器设备
•     3.1.5 WPAGA1中琼胶酶系预测及aga2660序列分析
•     3.1.6 琼胶酶基因aga2660的克隆表达及重组质粒的构建
•     3.1.7 rAga2660的胞内诱导表达
•     3.1.8 rAga2660的纯化及SDS-PAGE分析
•     3.1.9 rAga2660酶活力检测
•     3.1.10 rAga2660诱导表达条件的优化
•     3.1.11 rAga2660最适温度及最适p H
•     3.1.12 rAga2660降解琼胶及不同聚合度寡糖的研究
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 WPAGA1中琼胶酶系预测及琼胶酶基因aga2660序列分析
•     3.2.2 琼胶酶基因aga2660的克隆表达及纯化
•     3.2.3 rAga2660诱导表达条件的优化
•     3.2.4 rAga2660最适温度及最适p H
•     3.2.5 rAga2660酶解产物的分析
•   3.3 讨论
• 4 新琼二糖的酶法制备及其美白功效评估
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 材料与试剂
•     4.1.2 仪器设备
•     4.1.3 新琼二糖的酶法制备
•     4.1.4 细胞毒性检测方法
•     4.1.5 基于 3D黑色素皮肤模型Mela Kutis?进行的美白功效评估
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 新琼四、六糖基于人角质形成细胞的细胞毒性检测
•     4.2.2 新琼四、六糖基于人成纤维细胞的细胞毒性检测
•     4.2.3 新琼二糖基于人角质形成细胞的细胞毒性检测
•     4.2.4 新琼二糖基于人成纤维细胞的细胞毒性检测
•     4.2.5 黑色素模型表观评估
•     4.2.6 黑色素模型L*值检测
•     4.2.7 黑色素分布检测结果
•   4.3 讨论
• 5 总结与展望
•   5.1 总结
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录A 普通DNA产物纯化试剂盒步骤
• 附录B 大肠杆菌感受态的制备及重组质粒的转化
• 附录C 大肠杆菌中质粒提取试剂盒步骤
• 附录D 枯草芽孢杆菌感受态的制备及重组质粒的转化
• 附录E BCA蛋白浓度测定试剂盒步骤
• 硕士期间发表的论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李丽

导师: 曾润颖

关键词: 海洋沉积物,琼胶酶,新琼二糖

来源: 自然资源部第三海洋研究所

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 自然资源部第三海洋研究所

分类号: Q78;O636.1

总页数: 100

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