膜联蛋白AnxA1不依赖于E3泛素连接酶的单泛素化修饰

论文摘要

泛素化修饰作为蛋白质翻译后修饰的一种常规修饰,在调节细胞各种过程中执行着非常重要的作用。经典的泛素化修饰主要通过E1泛素激活酶,E2泛素结合酶以及E3泛素连接酶对泛素的级联传递最后将泛素修饰到底物上,调节底物蛋白的稳定性、酶活性、细胞定位等。2007年,Daniela Hoeller等科学家提出在体外泛素化反应时,没有E3泛素连接酶参与的条件下底物蛋白通过泛素结合结构域（ubiquitin binding domain,UBD）与泛素结合从而把E2上活化的泛素通过异肽键连接到底物的赖氨酸残基上,并把这种泛素化修饰命名为不依赖于E3泛素连接酶的非经典泛素化修饰。后续科学家们又鉴定到这种不依赖于E3泛素连接酶的非经典泛素化修饰参与调解激酶活性、转录调控、DNA修复等,证实了这种泛素化修饰方式在生命活动中普遍存在。膜联蛋白家族（annexin family）是普遍存在于各种真核生物中且高度保守的一类蛋白质,在各种生命活动中执行着重要的功能。作为最先被鉴定出来的膜联蛋白家族成员,膜联蛋白A1（annexin A1,AnxA1）从上世纪70年代鉴定出来后就一直被广泛研究。AnxA1已经被验证出参与细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应以及细胞癌变等各种细胞过程,调控这些生命活动时,AnxA1的蛋白水平一直起着关键的作用。在头颈癌中AnxA1的蛋白量可以作为一个判断细胞癌变周期的标志蛋白。虽然AnxA1的蛋白含量对细胞的调节如此重要,但目前对AnxA1的降解机制却鲜有研究。我们通过蛋白质相互作用,找到了可以直接与AnxA1相互作用的泛素结合酶UbcH5家族蛋白,通过细胞中Co-IP以及纯蛋白pulldown实验验证了这种相互作用是直接相互作用的而不是通过蛋白复合体的间接互作。通过对AnxA1的结构域剪切,鉴定到AnxA1与UbcH5家族蛋白的互作是通过N端结构域起作用的。通过在细胞中过表达UbcH5家族蛋白后,鉴定到AnxA1上具有单泛素化修饰。再通过使用纯蛋白进行体外泛素化修饰实验,发现泛素可以直接通过UbcH5家族蛋白转移到AnxA1上而不需要E3泛素连接酶的参与。这种不需要E3泛素连接酶的非经典泛素化修饰途径和之前报道的非经典泛素化修饰的模式不同,Alexander Sorkin在2007年提出的两种不依赖于E3泛素连接酶的泛素化修饰都是通过底物含有的UBD结构域结合Ub,再通过泛素结合酶把泛素转移到底物上。AnxA1蛋白序列中不含有UBD结构域,我们验证其泛素化途径主要通过N端结构域结合UbcH5后,把UbcH5上活化的Ub转移到AnxA1上。AnxA1与UbcH5家族蛋白的结合受到钙离子浓度的调节,过高或低浓度的钙离子都会影响AnxA1与UbcH5家族蛋白的结合。我们推测AnxA1结合钙离子时其8个结合位点的结合能力不一致,钙离子通过与不同钙离子结合位点的结合可以调节AnxA1形成不同的蛋白结构。对于这种钙离子浓度依赖性调节的AnxA1的结构多样性,为其在细胞中的多样功能提供基础。钙离子浓度不但调节UbcH5家族蛋白与AnxA1的结合,还会对UbcH5家族蛋白对AnxA1的泛素化起着调节作用。说明AnxA1的泛素化修饰依赖于对UbcH5家族蛋白的结合。在细胞中过表达UbcH5家族蛋白后,AnxA1的蛋白含量会有明显的下调。通过对蛋白合成的抑制,我们发现UbcH5家族蛋白能够促进AnxA1的降解。通过对不同降解途径的抑制我们发现UbcH5家族蛋白促进AnxA1的降解不是通过蛋白酶体途径降解的,而是通过溶酶体降解的。这种降解可能是由于UbcH5家族蛋白单泛素化修饰AnxA1后对其亚细胞定位产生了影响,使其定位到溶酶体中进行降解。这种对于AnxA1的降解,或许在细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应以及细胞癌变过程中起着重要的作用。总而言之,我们通过细胞以及体外实验验证了UbcH5家族蛋白可以与膜联蛋白AnxA1直接发生钙离子浓度依赖性的相互作用。通过与AnxA1的相互作用,UbcH5家族蛋白可以通过一种新颖的不依赖于E3泛素连接酶的非经典泛素化修饰模型将AnxA1单泛素化修饰。AnxA1的这种单泛素化修饰调节AnxA1定位于溶酶体进行降解,从而降低了细胞中AnxA1的蛋白含量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 研究背景
•   1.1 经典泛素化系统
•     1.1.1 泛素化修饰的基本简介
•     1.1.2 泛素化系统的关键组成蛋白
•     1.1.3 泛素链的类型
•   1.2 非经典泛素化修饰—不依赖于E3的泛素化修饰
•   1.3 膜联蛋白1（Annexin A1,AnxA1）
•     1.3.1 膜联蛋白家族（Annexin family）
•     1.3.2 AnxA1 蛋白简介
•     1.3.3 AnxA1 互作的蛋白
•     1.3.4 AnxA1 在细胞中的定位
•     1.3.5 AnxA1 的研究现状
• 第2章 引言
•   2.1 选题背景
•   2.2 研究的目的与意义
• 第3章 材料与方法
•   3.1 试剂、耗材与仪器
•     3.1.1 试剂与耗材
•     3.1.2 仪器与设备
•   3.2 培养基和主要试剂的配制
•     3.2.1 细菌培养用培养基的配制
•     3.2.2 蛋白表达纯化相关试剂的配制
•     3.2.3 核酸相关溶液的配制
•     3.2.4 SDS-PAGE各种缓冲液
•   3.3 质粒、菌株和细胞
•   3.4 实验方法
•     3.4.1 cDNA的制备
•     3.4.2 化学转化感受态的制备
•     3.4.3 重组质粒的构建与表达鉴定
•     3.4.4 原核表达蛋白纯化
•     3.4.5 实验所需质粒的构建及所用质粒统计
•     3.4.6 实验所需蛋白表达、纯化方法及来源
•     3.4.7 细胞培养、转染及细胞处理
•     3.4.8 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）及pulldown
•     3.4.9 体外泛素化反应
•     3.4.10 蛋白免疫印迹
• 第4章 结果
•   4.1 前言
•   4.2 结果
•     4.2.1 AnxA1 的克隆、表达与纯化
•     4.2.2 UbcH5对AnxA1 的不依赖E3 泛素连接酶的泛素化修饰
•     4.2.3 UbcH5对AnxA1 的降解
•     4.2.4 AnxA1与UbcH5 家族蛋白的相互作用
•     4.2.5 钙离子浓度调节AnxA1与UbcH5 的结合
•     4.2.6 AnxA1 通过N端结构域与UbcH5 发生相互作用
• 第5章 结论与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘小亮

导师: 李洪涛

关键词: 非经典泛素化,降解

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

基金: 国家自然科学基金项目(30970630,31270831),重庆市杰出青年科学基金(cstc2011jjjq10003)

分类号: Q51

DOI: 10.27684/d.cnki.gxndx.2019.000036

总页数: 67

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