STGC3基因突变载体的构建及其在CNE2细胞中的表达

论文摘要

目的 :构建STGC3基因单碱基位点突变载体并观察CNE2细胞中STGC3蛋白表达情况,为探讨STGC3基因发挥抑瘤作用的功能性位点提供前期基础。方法 :针对STGC3基因糖基化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化3个（656C、725C、913T）可能性功能位点,运用Stratagene定点突变技术,对STGC3基因656C、725C、913T位点分别进行单碱基定点突变,使656C突变为G,725C突变为T,913T突变为G,构建突变表达质粒,同时构建野生型质粒为对照。质粒经转化、抽提、酶切及测序鉴定。将重组真核表达质粒,用脂质体转染至鼻咽癌CNE2细胞系,经G418筛选,得到稳定表达STGC3基因3种突变型CNE2细胞系。实验设6组,即空白对照组（Negative control）、空载体组（Vector）、野生型组（His-STGC3）和3个STGC3基因突变型组（His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T、His-STGC3-T913G）。运用RT-PCR、免疫印迹及免疫细胞化学,观察重组质粒突变型STGC3基因是否正常表达。结果 :突变质粒经酶切和测序鉴定,酶切结果显示目的片段大小一致,测序结果显示突变序列正确,成功构建带His标签的3个突变型（His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T、His-STGC3-T913G）重组真核表达质粒。RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学结果显示,突变质粒均正常表达His-tag-STGC3基因及融合蛋白质,融合蛋白定位于细胞质和细胞核。结论 :成功构建STGC3基因单碱基位点突变质粒,并在CNE2细胞中表达STGC3融合蛋白。

论文目录

• 1 材料和方法
•   1.1 质粒与试剂
•   1.2 引物设计与合成
•   1.3 构建pcDNA3.1TM/myc-HisB-STGC3重组质粒
•   1.4 构建Stratagene定点突变质粒
•   1.5 重组突变质粒转染CNE2细胞
•   1.6 基因转录产物检测
•   1.7 免疫印迹检测细胞表达产物
•   1.8 细胞表达产物免疫细胞化学检测
• 2 结果
•   2.1 Stratagene构建3个突变质粒
•   2.2 突变质粒酶切与测序鉴定
•   2.4 CNE2细胞总RNA的测定
•   2.5 转染细胞STGC3基因mRNA表达
•   2.6 转染细胞STGC3蛋白的表达
•   2.7 转染细胞免疫细胞化学显色
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李素云,刘慧晴,刘芳,周小兵,贺修胜

关键词: 基因,质粒,突变

来源: 解剖学杂志 2019年05期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 南华大学应用解剖与生殖医学研究所,南华大学,南华大学肿瘤研究所

基金: 湖南省科技厅资助项目(2012TT2020),南华大学博士启动基金(2016XQD14),湖南省大学生研究性学习与创新性实验资助项目(2018XJXZ154)

分类号: Q78

页码: 453-457

总页数: 5

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