丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究

论文摘要

HCV（Hepatitis C virus,HCV）丙型肝炎病毒是属于黄病毒科、丙型肝炎病毒属的单股正链RNA病毒。HCV在全球总人口的大约百分之一中以慢性感染的形式存在,因此HCV感染一直以来是一个沉重的社会负担。近年来直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral agents,DAA）的出现使得HCV病人的治疗得到极大的改观。但临床资料显示DAA的耐药突变的产生仍是一个严峻的问题。绝大多数HCV病人样品中的HCV病毒无法在体外的肝癌细胞系中建立高效的感染,该现象的分子机制仍未被完全阐明。第一个高效的HCV体外感染模型在2005年由三个实验室同时创建并都依赖了JFH1（Japanese fulminant hepatitis1）共有序列。但迄今为止,JFH1共有序列是唯一一个不需要任何额外改变就能在肝癌细胞系中建立高效感染的HCV序列。由于共有序列无法反映出体内复制HCV序列的真实状态,因此我们拟通过筛选HCV病人血清中准种序列的方法来提高获得具有复制能力序列的可能性。为此我们建立了一种高效的构建HCV复制子cDNA文库的方法,并在稳定表达Sec14L2的Huh7.5.1细胞系中测试了多种基因型HCV复制子cDNA文库的集落形成能力。通过上述的功能筛选策略,我们成功地获得了基因1b,3a,6a型的HCV复制子克隆细胞,而且我们所获得的亚克隆HCV复制子cDNA都有较强的复制能力。后续的序列分析表明每个复制子细胞克隆中都含有不同数量的来自于准种序列的突变,因此我们的实验结果证明来自于准种序列的多样性可以帮助HCV病毒株在肝癌细胞系中复制。使用DAA疗法的基因3型病人的SVR（Sustained virological response）显著低于其他基因型。这个临床现象中比较重要的一个原因是基因3型HCV拥有天然的NS3 DAA耐药性。我们通过基因3a型复制子PR87A7研究了基因3型NS3168Q所介导的NS3 DAA耐药性。并且通过在基因2型的JFH1复制子中引入NS3 168Q及相关位点研究了NS3 168Q稳定存在的分子机制。我们发现NS3168Q的稳定存在需要NS3蛋白酶中其他残基的帮助,其中包括123T。研究显示索磷布韦耐药位点NS5B S282T可以在基因6型病人的基线序列中以较高的频率出现,因此基因6型HCV病毒株中产生索磷布韦耐药突变的壁垒可能低于其他基因型的HCV毒株。为了证明我们的假设,我们研究了基因6a型复制子PR58C4针对索磷布韦的耐药特性,结果显示PR58C4产生NS5B S282T的分子壁垒显著低于基因1b型的Con1复制子。NS5B S282T的产生导致了PR58C4对索磷布韦处理的敏感型的降低,并且NS5B K535R与NS5B S282T的同时存在可能提高了后者的耐药表型。综上所述,我们的研究建立了一种可以用于多种基因型HCV病人样本的复制子构建方法。基因1b型PR50,基因3a型PR87,基因6a型PR58复制子克隆的成功建立证明了我们上述功能筛选策略的通用性及有效性。在基因3a型PR87的耐药研究中,我们的结果对理解HCV耐药突变的产生与病毒复制能力维持之间的平衡提供了新的思路。在基因6a型PR58的索磷布韦耐药研究中,我们发现其产生NS5B S282T耐药突变的分子壁垒较低,同时发现了一个可以提高S282T耐药能力的突变K535R,这对理解临床中复杂耐药性的产生有重要意义。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
•   1.1 丙型肝炎病毒的流行病学
•   1.2 丙型肝炎病毒的基因型分布
•   1.3 丙型肝炎病毒的分子病毒学
•     1.3.1 丙型肝炎病毒的基因组结构
•     1.3.2 丙型肝炎病毒的生活周期
•   1.4 丙型肝炎病毒的研究模型
•     1.4.1 丙型肝炎病毒的假病毒模型
•     1.4.2 丙型肝炎病毒的亚基因组复制子模型
•     1.4.3 丙型肝炎病毒的细胞感染模型
•     1.4.4 丙型肝炎病毒的动物模型
•   1.5 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的发展
•     1.5.1 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的分类
•     1.5.2 直接抗病毒药物相关的耐药突变的总结
•   1.6 本课题研究背景
•   1.7 本课题研究目标
• 第二章 实验材料与试验方法
•   2.1 细胞培养
•   2.2 蛋白抗体
•   2.3 HCV直接抗病毒药物
•   2.4 病人血清的来源及RNA的抽提
•   2.5 多规格孔板的细胞实验
•   2.6 复制子单克隆的分离
•   2.7 PCR体系
•   2.8 质粒回收与琼脂糖电泳产物回收
•   2.9 大肠杆菌感受态DH5α的制备与转化
•   2.10 酿酒酵母感受态W303 的制备与转化
•   2.11 质粒构建
•   2.12 TA平末端克隆与限制性内切酶
•   2.13 RNA抽提与反转录
•   2.14 HCV RNA的体外转录与转染
•   2.15 直接抗病毒药物敏感性的测试
•   2.16 免疫荧光
•   2.17 免疫印迹
•   2.18 HCV序列的生物信息学分析
• 第三章 实验结果
•   3.1 丙型肝炎病毒亚基因组复制子新型构建方法的建立
•     3.1.1 丙型肝炎病毒复制子cDNA文库的构建
•     3.1.2 丙型肝炎病毒复制子细胞的建立
•     3.1.3 基因1b型病毒复制子细胞复制特点的研究
•     3.1.4 基因3a型病毒复制子细胞复制特点的研究
•     3.1.5 基因6a型病毒复制子细胞复制特点的研究
•   3.2 基因3a型丙型肝炎病毒亚基因组复制子耐药相关的研究
•     3.2.1 基因3a型复制子对直接抗病毒药物的敏感性研究
•     3.2.2 基因3a型复制子对NS3 抑制剂耐药机制的研究
•     3.2.3 基因3a型复制子NS3 抑制剂耐药位点D168Q稳定存在的机制研究
•   3.3 基因6a型丙型肝炎病毒对索磷布韦耐药机制的研究
•     3.3.1 基因6a型复制子索磷布韦耐药性的诱导
•     3.3.2 基因6a型复制子耐药型细胞克隆的特点分析
•     3.3.3 基因6a型丙型肝炎病毒索磷布韦耐药位点的鉴定研究
• 第四章 讨论
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 缩略词
• 作者简历
• 专业综述
•   参考文献

文章来源

类型: 博士论文

作者: 郭明哲

导师: 钟劲

关键词: 丙型肝炎病毒,基因型,抗病毒,耐药性

来源: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

分类号: R373.21

DOI: 10.27915/d.cnki.gkbsd.2019.000007

总页数: 105

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