导读:本文包含了减毒伤寒杆菌论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:伤寒,大肠杆菌,沙门氏菌,杆菌,疫苗,小家鼠,基因。
减毒伤寒杆菌论文文献综述
邹雅洁[1]（2016）在《表达大肠杆菌外膜蛋白抗原的减毒鸡伤寒沙门菌重组疫苗的构建及免疫保护研究》一文中研究指出鸡大肠杆菌病(Chicken Colibacillosis)是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的传染病,感染该病会造成鸡体局部或全身性感染并引起一系列疾病最终导致死亡,该病已成为危害养禽业的重要疫病之一。鸡大肠杆菌病的防控和治疗以药物和疫苗为主,抗菌药物仍是主要防治措施。但随着人们对抗菌药物越来越广泛的使用,大肠杆菌的耐药性、药物残留等问题日趋突出,近些年来,由于这些问题抗生素的使用遭到了广泛的置疑和反对。预防该病最有效的方法是接种疫苗,采取疫苗预防与合理用药相结合的措施是最为有效的方法。因此开发具有交叉保护的广谱疫苗是防控本病的重中之重。本研究选择减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R株为宿主菌,以asd基因作为营养缺陷标志,以编码大肠杆菌外膜蛋白的S632基因为外源基因,构建减毒鸡伤寒沙门氏菌染色体-质粒平衡致死系统表达大肠杆菌外膜蛋白抗原,以探讨该重组口服疫苗对预防禽致病性大肠杆菌的保护效果。1.大肠杆菌外膜蛋白基因S632的克隆与原核表达本研究根据GenBank发表的大肠杆菌外膜蛋白的主要编码基因S632序列,采用DNAStar序列分析软件对比分析,针对S632设计一对引物。以江苏省42株疑似大肠杆菌的临床分离株为模板,PCR扩增目的片段S632,将目的片段克隆至pMD 19-T simple vector,而后转化大肠杆菌DH5a,经筛选鉴定后对其进行测序并对结果进行分析。发现其中有28株菌为大肠杆菌,测序结果表明,S632在大肠杆菌中普遍存在且高度保守。将已构建的重组质粒pET-42a-S632转化BL21(DE3)进行诱导培养,当以终浓度为1.0mM IPTG诱导4h时表达量最高,检测到分子量大约为63 KDa的目的蛋白。通过SDS-PAGE分析,该融合蛋白为包涵体,通过尿素变性、复性及镍柱亲和层析纯化的方法,最终获得浓度为0.964mg/ml的纯化融合蛋白,命名为pS632。该蛋白可作为包被抗原,为后续ELISA实验检测特异性抗体提供了材料。2.表达大肠杆菌共同外膜蛋白抗原的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌构建及免疫效果研究利用PCR技术扩增出编码大肠杆菌外膜蛋白的基因S632,将其插入含有asd基因的表达载体pYA3342中,构建重组表达载体pYA3342-S632,再将重组质粒电转化至已缺失编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶的asd基因的减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R△asd突变株中,构建重组减毒鸡伤寒沙门氏菌活疫苗SG9R (pYA3342-S632)。并对重组菌的生长特性、口服安全性等生物学特性进行评定。将重组菌SG9R (pYA3342-S632_、SG9R (pYA3342)接种20日龄非免疫SPF鸡,分别作为免疫组及载体对照组,同时以PBS组为空白对照组。分别采集各组免疫鸡免疫后不同时间段血清,利用间接ELISA法测定其体内特异性IgG抗体动态水平,首次免疫14d后,重组疫苗菌免疫组血清IgG抗体水平明显高于空载体对照组和PBS空白对照组(P<0.05),差异显着；而空载体对照组与PBS空白对照组之间无显着性差异(P>0.05)。在二免两周后收集并制备气管粘膜液样品和肠粘膜液样品,利用间接ELISA法测定其体内特异性sIgA抗体水平,SG9R (pYA3342-S632)免疫组可在鸡的十二指肠粘膜中检测到特异性s1gA抗体。免疫后,每组每周随机抽取3只试验鸡,分离外周血淋巴细胞,利用流式细胞术(FCM)监测每组鸡外周血中CD3+和CD8+T淋巴细胞动态变化。结果显示,免疫后外周血中CD3+T细胞及CD8+T细胞含量均呈逐渐增加的趋势,各时期含量均高于PBS对照组,在二次免疫一周后达到较高水平随后保持平稳。用禽致病性大肠杆菌强毒株QD2(O78:H54)分别对各实验组进行后胸气囊攻毒,观察10 d内,重组疫苗菌免疫组、空载体对照组及空白对照组的死亡率分别为20.0%、70.0%和80.0%。用肠炎沙门氏菌50336菌株进行攻毒,PBS空白对照组的死亡率高达90%,重组疫苗菌免疫组和空载体对照组死亡率分别为60%和70%。上述结果显示,重组疫苗对禽致病性大肠杆菌具有较好的免疫保护效果。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-04-01）
刘滢[2]（2009）在《pGEX-6p-1-Ag85A载体的构建表达与口服减毒伤寒杆菌携带Ag85A DNA疫苗免疫效应的研究》一文中研究指出前言目前全球约叁分之一人口受到结核杆菌感染,每年死亡人数约300万人,卡介苗(BCG)作为目前唯一临床使用的疫苗,其预防效果并不稳定,研制新型的有效疫苗防治结核病成为当务之急。迄今为止对于结核杆菌的保护性抗原仍不十分明确,细胞外分泌性或细胞壁相关的蛋白被推测是保护性免疫应答识别的重要抗原。分泌型Ag85A被认为可作为结核病DNA疫苗的候选目的抗原。比利时布鲁塞尔巴斯德研究所Huygen研究组多年来在对Ag85进行的研究中发现,携带Ag85基因的质粒DNA疫苗经肌肉注射给动物(小鼠),主要引起Th1型免疫应答,产生IL-2、IFN-γ和TNF-α,经基因枪注射则主要产生Th2型免疫应答和抗体产生水平增加。而口服减毒沙门氏菌携带Ag85DNA疫苗对小鼠免疫效应的影响目前尚无报道。通过基因工程制备的减毒沙门氏菌以其有效地递呈抗原、发挥免疫佐剂作用以及激发黏膜免疫等优势而被广泛用于DNA疫苗新型细菌载体的研究。减毒沙门氏菌经口服途径免疫小鼠,不仅安全、高效,而且可激发产生黏膜反应,对同源病原体和异源病原体均表现出良好的保护力。本实验构建了pGEX-6p-1-Ag85A载体并表达Ag85A蛋白,用以检测Ag85A特异性抗体及用于单克隆抗体的制备。并用减毒沙门氏菌携带Ag85A真核表达载体经口服途径免疫小鼠,检测其免疫效应,为结核病DNA口服疫苗的临床应用进一步提供理论和实验依据。实验材料一、主要仪器流式细胞仪,二氧化碳孵箱,倒置显微镜,酶标仪,离心机,低温冰箱,超速离心机,超滤器,超净工作台等。二、主要试剂RPMI 1640培养基,大肠杆菌(Ecoli)BL21株,质粒pGEX-6p-1,AxyprepPlasmid Miniprep Kit,Axyprep DNA Gel Extraction Kit,Easy Taq DNA Polymerase,High Pure dNTPs,T4 DNA连接酶,Western-blot相关试剂,IPTG,BamHⅠ、EcoRⅠ、BglⅡ限制性内切酶,SDS-PAGE电泳相关试剂,IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒。叁、实验动物C57BL/6小鼠,6-8周龄,SPF级,购自中科院上海实验动物中心。实验方法一、pGEX-6p-1-Ag85A载体的构建与表达1、质粒的提取与鉴定取出-70℃冻存的运载V1Jns.tPA-Ag85A质粒的减毒伤寒杆菌,用AxyprepPlasmid Miniprep Kit提取质粒,用限制性内切酶BglⅡ37℃水浴消化质粒,,酶切结果经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2、Ag85A编码基因的扩增以V1Jns.tPA-Ag85A为模板,PCR扩增目的基因Ag85A。3、重组质粒pGEX-6p-1-Ag85A的构建用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切Ag85A PCR产物和pGEX-6p-1载体,用T4 DNA连接酶进行连接。4、转化及重组质粒鉴定将重组质粒转化大肠杆菌(Ecoli)BL21,用Axyprep Plasmid Miniprep Kit提取质粒,BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定并测序。5、蛋白表达检测IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blotting检测蛋白表达情况。二、口服减毒伤寒杆菌携带Ag85A DNA疫苗免疫效应的研究1、口服疫苗的制备取出-70℃冻存的运载V1Jns.tPA-Ag85A质粒的减毒伤寒杆菌,用AxyprepPlasmid Miniprep Kit从细菌中提取质粒,用限制性内切酶BglⅡ于37℃水浴消化质粒,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取收获的细菌进行10倍的倍比稀释后,将10~6,10~7,10~8倍稀释的菌液各取100μl接种于含有卡那霉素的固体琼脂平板中,计数菌落数。并依据公式推算出所收获细菌悬液中的细菌总数。2、实验动物分组及免疫C57BL/6小鼠,6-8周龄,雌性,随机分成3组:①Ag85A DNA质粒组;②空质粒对照组;③正常对照组。分别将伤寒杆菌菌苗和生理盐水以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫叁次,每次间隔叁周。分别于初次免疫后2w,4w,6w,8w颈椎脱位处死每组3-4只小鼠进行相关检测。3、ELISA法检测血清中Ag85A特异性抗体滴度眼球采血分离血清,ELISA法检测小鼠血清中Ag85A特异性抗体,酶标仪于450nm处测量OD值。4、ELISA法检测脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量无菌取出感染小鼠脾脏,制成细胞悬液并调整脾细胞终浓度为1×10~7/ml,24孔培养板上加入细胞悬液,500μl/孔,于37℃培养48h。1000g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待IFN-γ和IL-4检测。用双抗体夹心ELISA法对IFN-γ和IL-4的含量进行检测,酶标仪于450nm处检测OD值,应用SoftMax Pro4.3.1 LS软件分析,绘制标准品标准曲线,计算细胞因子含量(pg/ml)。5、统计学处理实验数据经SPSS16.0统计分析软件应用方差分析方法进行统计处理,P<0.05有显着性差异。结果1、pGEX-6p-1-Ag85A载体的构建经双酶切证实成功构建了携带Ag85A基因的重组质粒pGEX-6p-1-Ag85A,经测序分析,所克隆Ag85A基因序列与GenBank中结核分枝杆菌Ag85A序列完全相同。2、Ag85A蛋白的表达SDS-PAGE电泳及Western-blot检测IPTG诱导Ecoli BL21蛋白表达,在分子量为58KDa处有Ag85A融合蛋白的表达,与预期的蛋白分子量一致。3、血清中Ag85A特异性抗体滴度初次免疫后Ag85A DNA质粒组小鼠抗Ag85A抗体略有增高,滴度为1:50;第二次免疫后Ag85ADNA质粒组小鼠血清中的抗体水平迅速升高,而空质粒对照组小鼠血清中Ag85A抗体始终为阴性。4、口服免疫后不同时间脾细胞上清中IFN-γ的分泌水平初次免疫后,Ag85A DNA质粒组小鼠脾细胞培养上清中的IFN-γ水平即出现有意义的升高(P<0.01),至初次免疫后8w,Ag85A DNA质粒组小鼠IFN-γ浓度达到1400pg/ml,与其它两组差异明显(P<0.01)。空质粒对照组和正常对照组小鼠IFN-γ水平也有所增长,但二者之间没有统计学差异(P>0.05)5、口服免疫后不同时间脾细胞上清中IL-4的分泌水平经过叁次Ag85A DNA疫苗口服免疫,Ag85A DNA质粒组,空质粒对照组和正常对照组叁组小鼠脾细胞上清中IL-4水平均未见明显增长,且浓度较低,叁组之间无显着差异(P>0.05)讨论Ag85复合物是一类30-32kDa的蛋白质家族,它是结核分枝杆菌和BCG培养滤液分泌蛋白的主要成分之一,其中分泌型Ag85A蛋白可作为结核病DNA疫苗的候选目的抗原。本实验用减毒沙门氏菌携带保护性抗原Ag85A真核表达载体经口服途径免疫小鼠,重点观察口服DNA疫苗经肠粘膜摄取后血清中特异性抗体,脾细胞培养上清IFN-γ和IL-4的产生情况,结果提示小鼠血清中特异性抗体水平在初次免疫后即有升高,加强免疫后升高更明显,末次免疫后抗体滴度达到了1:400,这说明口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85A DNA疫苗能有效地诱导小鼠全身性体液免疫应答。脾细胞培养上清IFN-γ分泌水平大幅度升高,且与空质粒对照组和正常对照组相比有显着性差异(P<0.01),提示口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85A DNA疫苗具有刺激小鼠产生抗结核菌免疫所需的Th1型免疫应答,这与Huygen等报道的肌注Ag85A DNA疫苗产生的结果一致。Tanghe等证明,Ag85A DNA疫苗在不同品系小鼠可诱导产生不同类型的免疫应答,其中对C57BL/6小鼠可以诱导出强烈的细胞免疫和体液免疫应答,而投给人体刺激何种类型的免疫应答尚需做进一步研究。结论1、成功构建了pGEX-6p-1-Ag85A载体,并表达Ag85A蛋白,为Ag85A特异性抗体的检测和单克隆抗体的制备奠定了基础。2、口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85A DNA疫苗后,有效刺激了抗Ag85A特异性抗体的产生。3、口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85ADNA疫苗后脾细胞培养上清IFN-γ分泌水平大幅度升高,而IL-4含量未见升高,提示口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85ADNA疫苗能刺激机体产生Th1型免疫应答。(本文来源于《中国医科大学》期刊2009-03-01）
王其龙,王坤,孙平,刘胜武,章晓联[3]（2008）在《携带结核杆菌Ag85B、ESAT6的减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗的研究》一文中研究指出结核病(Tuberculosis,TB)是一种由结核杆菌感染引起的严重危害人类健康的传染病。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示,全球有近1/3的人感染结核杆菌,每年有300万人死于结核病,每年新发病人数达800～1000万。卡介苗(BCG)是目前唯一的结核预防性疫苗,但其对成人结核病的预防效果不稳定,保护效果从0%～80%不等,而且会干扰对结核病的诊断。因此寻找一种安全、有效、廉价且操作简便的预防结核病的新型疫苗成为当务之急。(本文来源于《2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集》期刊2008-11-07）
杨冬梅,陈创夫,王鹏雁,王远志,李有文[4]（2008）在《大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与表达》一文中研究指出本研究为构建表达产肠毒素性大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,从质粒pET-K88ac-STⅡ中扩增编码融合蛋白K88ac-STⅡ的基因并插入线性T载体pBS-T中,经酶切、PCR、测序鉴定正确后,再用限制性内切酶切下,插入含有asd基因的表达载体pYA3334,构建pYA-K88ac-STⅡ重组质粒。重组质粒鉴定正确后电穿孔转入缺失腺苷酸环化酶基因(△cya)、环腺苷酸受体蛋白基因(△crp)以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因(△asd)的鼠伤寒沙门菌(X4550)中,以获得重组菌株X4550(含pYA-K88ac-STⅡ)。结果显示该无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖,口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。通过本试验成功构建了表达K88ac-STⅡ融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4550(含pYA-K88ac-STⅡ)。为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2008年02期）
罗风玲,冯勇,吴建国,章晓联[5]（2007）在《染色体上携带SARS病毒N基因的减毒伤寒杆菌疫苗的研究》一文中研究指出目的构建能稳定表达 SARS 病毒 N 蛋白的减毒伤寒杆菌疫苗,并研究其免疫原性。方法构建含有伤寒杆菌毒力岛 IVB 型菌毛 pilV 基因及 SARS 病毒 N 基因的重组质粒,转化入 IVB 型菌毛结构基因 pilS 基因缺失突变的减毒伤寒杆菌株(本文来源于《第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会论文集》期刊2007-10-01）
罗风玲,冯勇,吴建国,章晓联[6]（2007）在《染色体上携带SARS病毒N蛋白的减毒伤寒杆菌疫苗的研究》一文中研究指出目的构建能稳定表达 SARS 病毒 N 蛋白的减毒伤寒杆菌疫苗,并研究其免疫原性。方法构建含有伤寒杆菌毒力岛 IVB 型菌毛 pinV 基因及 SARS 病毒 N 基因的重组质粒,转化入 IVB 型菌毛结构基因 pilS 基因缺失突变的减毒伤寒杆菌株(本文来源于《第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会论文集》期刊2007-10-01）
杨冬梅,陈创夫,王鹏雁,任艳[7]（2007）在《携带大肠杆菌融合基因K88ac-STII的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与鉴定》一文中研究指出为构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和热稳定肠毒素STII的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,采用缺失腺苷酸环化酶基因(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因(Δasd)的鼠伤寒沙门菌(X4550)作为宿主,将编码K88ac-STII的融合基因插入Asd+组成型表达载体pYA3334中,通过2次转化引入宿主菌,成功构建了表达K88ac-STII融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌株S.typhimuriumX4550(pYA3334K88ac-STII),为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。(本文来源于《石河子大学学报(自然科学版)》期刊2007年03期）
宁元元[8]（2007）在《以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7疫苗的实验研究》一文中研究指出研究背景及目的O157:H7是肠出血性大肠杆菌的一个主要血清型(本文简称为O157),感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎、也可引发溶血性尿毒综合征及血小板减少性紫癜等并发症,严重者可导致死亡。自1982年被确定为致病菌的20多年间,世界各地已发生了多起O157的暴发流行,表明O157的感染已成为一个全球性的公共卫生问题。然而目前缺乏有效的防治方法,研究证实抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx),从而使患者并发溶血性尿毒综合症的危险性增加,因此,研制O157疫苗对预防和控制O157感染有着极其重大的意义。EspA(大肠杆菌分泌蛋白A)、IntiminC300(紧密粘附素Intimin C端片段约1/3部分)和Stx2B(志贺毒素2 B亚单位)都是O157重要的保护性抗原。EspA作为O157Ⅲ型分泌系统的重要元件,在O157感染引起的宿主细胞A/E(attaching/effacing)损伤过程中起重要的桥梁作用。人和动物感染O157后,机体可产生高水平的EspA抗体。紧密粘附素(Intimin)介导细菌与肠上皮细胞的紧密粘附,是O157最主要的定植因子,尤其是它的C端约1/3部分(Intimin-C)为胞外功能区,可与相应受体结合,具有良好的免疫原性和免疫保护性。Stx2是O157致溶血性尿毒综合征的一个主要毒素,其中B亚单位(Stx2B)具有细胞结合的特性,表现出良好的免疫原性,而针对Stx2B的单克隆抗体具阻断毒素的作用。减毒沙门氏菌因为能够通过粘附、侵袭、定居在肠道相关淋巴组织,已被证实为有效的粘膜免疫载体工具,可经肠系膜淋巴结到达肝脏、脾脏,进一步有效地刺激机体产生粘膜、细胞和体液免疫应答。特别是近来利用不以抗生素作为选择压力的载体-宿主平衡致死系统构建的减毒沙门氏菌载体疫苗已显示出良好的应用前景。因此本实验利用pYA3149的载体-宿主平衡致死系统表达O157的EspA及其IntiminC300、Stx2B的融合保护性抗原,构建以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的肠出血性大肠杆菌O157:H7疫苗,并通过动物实验观察重组载体疫苗的免疫原性及免疫保护性,为发展新型的O157疫苗提供实验依据。实验结果:1.采用PCR技术扩增获得了579bp的EspA基因、1476bp的EspA-IntiminC300和1767bp的EspA-IntiminC300-Stx2B融合基因,经测序鉴定正确后分别连接到平衡-致死载体pYA3149上,再依次转化大肠杆菌DH5α的asd基因缺失突变株x6097、沙门氏菌中间宿主x3730及终宿主菌x4550。IPTG诱导重组工程菌x4550 (pYA3149- EspA)、X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149- EspA- Intimin C 300-Stx2B),成功表达了上述叁种抗原蛋白,免疫印迹证实所表达蛋白能与相应抗体发生抗原抗体反应。2.对重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗株进行体外稳定性实验, x4550 (pYA3149-EspA)、X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149- EspA- Intimin C300-Stx2B)在有选择压力(不含DAP)和无选择压力(含DAP)的条件下传10代后随机挑取100个菌落分别接种于不含DAP的LB平板及含DAP的LB平板上培养,结果无论有无选择压力存在,所挑取的菌落99%均生长,从中随机选出20个菌落抽提质粒,95%的菌落含有重组质粒。表明构建的重组工程菌在体外有较好的遗传稳定性。3.以重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗口服免疫叁次Balb/c小鼠后,各实验组免疫后血清特异性抗体GMT值与免疫前相比均差异显着(p<0.001),与对照组相比也差异显着(p<0.001)。叁次口服后再注射重组蛋白加强免疫一次,血清特异性抗体大幅增高(p<0.001)。4.利用肥达氏反应、SS选择培养、PCR、免疫荧光等方法检测,进一步证实重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗3次口服免疫后能在小鼠脾、Peyer,s结和回肠定植,且能特异表达O157的相关抗原。5.免疫后小鼠以1×109CFU/只剂量的O157全菌液进行攻毒免疫保护实验,结果表明3次口服重组载体疫苗后x4550(pYA3149-EspA)、x4550(pYA3149-EspA–Intimin C300)及x4550(pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B)组保护率分别为36%、44%和62%,注射重组蛋白加强免疫后保护率分别提高到56%、67%和89%。不经口服只注射蛋白抗原的小鼠,免疫后保护率为0%、11%、11%。结论:1.采用平衡-致死系统分别构建了表达O157:H7 EspA、EspA-IntiminC300及EspA-IntiminC300-Stx2B的重组减毒沙门氏菌载体疫苗株,并且构建的疫苗株无论有无选择压力均能稳定地在体外传代培养。2.构建的针对O157的重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗表现出良好的免疫原性和免疫反应性。叁次口服免疫Balb/c小鼠,重组菌能稳定地定植在小鼠的脾、PP结、回肠等部位,表达O157特异性抗原,刺激机体产生针对O157的特异性抗体,尤其是口服后注射抗原加强免疫组特异性抗体增高显着,能较好地保护小鼠抵抗O157的感染。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2007-05-01）
刘晓峰,孙自勤,刘长江,尚瑞莲[9]（2007）在《灌洗液法检测幽门螺杆菌减毒鼠伤寒杆菌疫苗诱导小鼠免疫应答的实验研究》一文中研究指出目的应用高渗灌洗液法(灌洗法)检测表达幽门螺杆菌(Hp)尿素酶 B 亚单位(ureB)的减毒鼠伤寒杆菌活菌重组疫苗口服免疫小鼠后的免疫应答状况。方法构建能表达 UreB 的重组减毒鼠伤寒杆菌 SL3261/pTC01-UreB,Western-blot 检测 UreB 的表达。将 SL3261/pTC01-UreB 口服免疫 Balb/c 小鼠,(本文来源于《中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（上册）》期刊2007-05-01）
杨冬梅[10]（2007）在《大肠杆菌K88ac-ST Ⅱ融合基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达与免疫》一文中研究指出为了构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和热稳定肠毒素STII融合基因的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,并对其免疫效果进行研究。根据GenBank中登录号为m29375的K88ac基因序列以及减毒鼠伤寒沙门氏菌原核表达载体pYA3334的多克隆位点设计特异性引物P1、P2,并在上下游引物的5’端分别引入NcoI和BamHI酶切位点,从大肠杆菌DE3(pET- K88ac-STⅡ)中通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到K88ac-STⅡ融合基因。回收纯化后将K88ac-STⅡ融合基因用T4DNA连接酶连于克隆载体pBS-T上,热击转化受体大肠杆菌Top10,蓝白斑筛选阳性菌落,酶切鉴定证明其中含有K88ac-STⅡ融合基因片段,再测序鉴定该融合基因序列的正确性,命名为pBS-K88ac-STⅡ。之后采用缺失腺苷酸环化酶基因(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因(Δasd)的鼠伤寒沙门氏菌(X4550)作为宿主,将编码K88ac-STII的融合基因切下插入Asd+组成型表达载体pYA3334中,鉴定后通过电转化引入宿主菌X4550中,再次酶切鉴定正确后,过夜培养进行SDS-PAGE和Western-Blot试验,检测其特异性蛋白表达情况。最后分别以重组菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII)灌服小鼠作为试验组,以转化了空载体的菌株X4550(pYA3334)作为空载体对照组,同时设PBS空白对照组,分别对叁个分组的小鼠进行免疫,采集血清检测其抗体效价,之后免疫小鼠用强毒株C83915(STⅡ﹢)攻击,观察结果。本实验成功构建了表达K88ac-STII融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门氏重组菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII),该重组菌株在33Kda处有特异性表达的蛋白条带,与预期分子量大小一致,而空载体对照菌X4550(pYA3334)在该处未有相应条带出现。Western-blot免疫印迹结果显示重组菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII)表达的蛋白能够被K88ac阳性血清特异性结合,在相应位置出现特异性显色条带。这证明重组菌株能够表达K88ac-STII特异性融合蛋白,重组菌的体外稳定实验也证明其有良好的稳定性,从而保证了K88ac-STII抗原能够得以持续表达。而且试验小鼠灌喂重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550 (pYA3334-K88ac-STII)后,能够产生特异性的抗体,而且对大肠杆菌强毒株具有一定的抵抗力。这为进一步研制相应的抗仔猪大肠杆菌病及相应的沙门氏菌病的双价活疫苗侯选株奠定了重要基础。(本文来源于《石河子大学》期刊2007-04-01）
减毒伤寒杆菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
前言目前全球约叁分之一人口受到结核杆菌感染,每年死亡人数约300万人,卡介苗(BCG)作为目前唯一临床使用的疫苗,其预防效果并不稳定,研制新型的有效疫苗防治结核病成为当务之急。迄今为止对于结核杆菌的保护性抗原仍不十分明确,细胞外分泌性或细胞壁相关的蛋白被推测是保护性免疫应答识别的重要抗原。分泌型Ag85A被认为可作为结核病DNA疫苗的候选目的抗原。比利时布鲁塞尔巴斯德研究所Huygen研究组多年来在对Ag85进行的研究中发现,携带Ag85基因的质粒DNA疫苗经肌肉注射给动物(小鼠),主要引起Th1型免疫应答,产生IL-2、IFN-γ和TNF-α,经基因枪注射则主要产生Th2型免疫应答和抗体产生水平增加。而口服减毒沙门氏菌携带Ag85DNA疫苗对小鼠免疫效应的影响目前尚无报道。通过基因工程制备的减毒沙门氏菌以其有效地递呈抗原、发挥免疫佐剂作用以及激发黏膜免疫等优势而被广泛用于DNA疫苗新型细菌载体的研究。减毒沙门氏菌经口服途径免疫小鼠,不仅安全、高效,而且可激发产生黏膜反应,对同源病原体和异源病原体均表现出良好的保护力。本实验构建了pGEX-6p-1-Ag85A载体并表达Ag85A蛋白,用以检测Ag85A特异性抗体及用于单克隆抗体的制备。并用减毒沙门氏菌携带Ag85A真核表达载体经口服途径免疫小鼠,检测其免疫效应,为结核病DNA口服疫苗的临床应用进一步提供理论和实验依据。实验材料一、主要仪器流式细胞仪,二氧化碳孵箱,倒置显微镜,酶标仪,离心机,低温冰箱,超速离心机,超滤器,超净工作台等。二、主要试剂RPMI 1640培养基,大肠杆菌(Ecoli)BL21株,质粒pGEX-6p-1,AxyprepPlasmid Miniprep Kit,Axyprep DNA Gel Extraction Kit,Easy Taq DNA Polymerase,High Pure dNTPs,T4 DNA连接酶,Western-blot相关试剂,IPTG,BamHⅠ、EcoRⅠ、BglⅡ限制性内切酶,SDS-PAGE电泳相关试剂,IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒。叁、实验动物C57BL/6小鼠,6-8周龄,SPF级,购自中科院上海实验动物中心。实验方法一、pGEX-6p-1-Ag85A载体的构建与表达1、质粒的提取与鉴定取出-70℃冻存的运载V1Jns.tPA-Ag85A质粒的减毒伤寒杆菌,用AxyprepPlasmid Miniprep Kit提取质粒,用限制性内切酶BglⅡ37℃水浴消化质粒,,酶切结果经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2、Ag85A编码基因的扩增以V1Jns.tPA-Ag85A为模板,PCR扩增目的基因Ag85A。3、重组质粒pGEX-6p-1-Ag85A的构建用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切Ag85A PCR产物和pGEX-6p-1载体,用T4 DNA连接酶进行连接。4、转化及重组质粒鉴定将重组质粒转化大肠杆菌(Ecoli)BL21,用Axyprep Plasmid Miniprep Kit提取质粒,BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定并测序。5、蛋白表达检测IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blotting检测蛋白表达情况。二、口服减毒伤寒杆菌携带Ag85A DNA疫苗免疫效应的研究1、口服疫苗的制备取出-70℃冻存的运载V1Jns.tPA-Ag85A质粒的减毒伤寒杆菌,用AxyprepPlasmid Miniprep Kit从细菌中提取质粒,用限制性内切酶BglⅡ于37℃水浴消化质粒,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取收获的细菌进行10倍的倍比稀释后,将10~6,10~7,10~8倍稀释的菌液各取100μl接种于含有卡那霉素的固体琼脂平板中,计数菌落数。并依据公式推算出所收获细菌悬液中的细菌总数。2、实验动物分组及免疫C57BL/6小鼠,6-8周龄,雌性,随机分成3组:①Ag85A DNA质粒组;②空质粒对照组;③正常对照组。分别将伤寒杆菌菌苗和生理盐水以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫叁次,每次间隔叁周。分别于初次免疫后2w,4w,6w,8w颈椎脱位处死每组3-4只小鼠进行相关检测。3、ELISA法检测血清中Ag85A特异性抗体滴度眼球采血分离血清,ELISA法检测小鼠血清中Ag85A特异性抗体,酶标仪于450nm处测量OD值。4、ELISA法检测脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量无菌取出感染小鼠脾脏,制成细胞悬液并调整脾细胞终浓度为1×10~7/ml,24孔培养板上加入细胞悬液,500μl/孔,于37℃培养48h。1000g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待IFN-γ和IL-4检测。用双抗体夹心ELISA法对IFN-γ和IL-4的含量进行检测,酶标仪于450nm处检测OD值,应用SoftMax Pro4.3.1 LS软件分析,绘制标准品标准曲线,计算细胞因子含量(pg/ml)。5、统计学处理实验数据经SPSS16.0统计分析软件应用方差分析方法进行统计处理,P<0.05有显着性差异。结果1、pGEX-6p-1-Ag85A载体的构建经双酶切证实成功构建了携带Ag85A基因的重组质粒pGEX-6p-1-Ag85A,经测序分析,所克隆Ag85A基因序列与GenBank中结核分枝杆菌Ag85A序列完全相同。2、Ag85A蛋白的表达SDS-PAGE电泳及Western-blot检测IPTG诱导Ecoli BL21蛋白表达,在分子量为58KDa处有Ag85A融合蛋白的表达,与预期的蛋白分子量一致。3、血清中Ag85A特异性抗体滴度初次免疫后Ag85A DNA质粒组小鼠抗Ag85A抗体略有增高,滴度为1:50;第二次免疫后Ag85ADNA质粒组小鼠血清中的抗体水平迅速升高,而空质粒对照组小鼠血清中Ag85A抗体始终为阴性。4、口服免疫后不同时间脾细胞上清中IFN-γ的分泌水平初次免疫后,Ag85A DNA质粒组小鼠脾细胞培养上清中的IFN-γ水平即出现有意义的升高(P<0.01),至初次免疫后8w,Ag85A DNA质粒组小鼠IFN-γ浓度达到1400pg/ml,与其它两组差异明显(P<0.01)。空质粒对照组和正常对照组小鼠IFN-γ水平也有所增长,但二者之间没有统计学差异(P>0.05)5、口服免疫后不同时间脾细胞上清中IL-4的分泌水平经过叁次Ag85A DNA疫苗口服免疫,Ag85A DNA质粒组,空质粒对照组和正常对照组叁组小鼠脾细胞上清中IL-4水平均未见明显增长,且浓度较低,叁组之间无显着差异(P>0.05)讨论Ag85复合物是一类30-32kDa的蛋白质家族,它是结核分枝杆菌和BCG培养滤液分泌蛋白的主要成分之一,其中分泌型Ag85A蛋白可作为结核病DNA疫苗的候选目的抗原。本实验用减毒沙门氏菌携带保护性抗原Ag85A真核表达载体经口服途径免疫小鼠,重点观察口服DNA疫苗经肠粘膜摄取后血清中特异性抗体,脾细胞培养上清IFN-γ和IL-4的产生情况,结果提示小鼠血清中特异性抗体水平在初次免疫后即有升高,加强免疫后升高更明显,末次免疫后抗体滴度达到了1:400,这说明口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85A DNA疫苗能有效地诱导小鼠全身性体液免疫应答。脾细胞培养上清IFN-γ分泌水平大幅度升高,且与空质粒对照组和正常对照组相比有显着性差异(P<0.01),提示口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85A DNA疫苗具有刺激小鼠产生抗结核菌免疫所需的Th1型免疫应答,这与Huygen等报道的肌注Ag85A DNA疫苗产生的结果一致。Tanghe等证明,Ag85A DNA疫苗在不同品系小鼠可诱导产生不同类型的免疫应答,其中对C57BL/6小鼠可以诱导出强烈的细胞免疫和体液免疫应答,而投给人体刺激何种类型的免疫应答尚需做进一步研究。结论1、成功构建了pGEX-6p-1-Ag85A载体,并表达Ag85A蛋白,为Ag85A特异性抗体的检测和单克隆抗体的制备奠定了基础。2、口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85A DNA疫苗后,有效刺激了抗Ag85A特异性抗体的产生。3、口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85ADNA疫苗后脾细胞培养上清IFN-γ分泌水平大幅度升高,而IL-4含量未见升高,提示口服减毒伤寒杆菌携带的Ag85ADNA疫苗能刺激机体产生Th1型免疫应答。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
减毒伤寒杆菌论文参考文献
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