霸王响应盐的差异表达基因分析及重要KUP家族蛋白的功能鉴定

论文摘要

土壤干旱和次生盐渍化是制约我国西北地区农牧业发展的主要非生物因素。为适应西北荒漠地区恶劣的生存环境,广泛分布于该地区的荒漠植物进化出独特的抗逆机制。对这些荒漠植物的抗逆机理开展研究,进而发掘和鉴定相关的抗逆基因资源,可为优良牧草和农作物的遗传改良奠定基础,并促进对干旱区盐碱化土地的开发利用。多浆旱生植物霸王（Zygophyllum xanthoxylum）是广泛分布于我国西北荒漠地区的积盐型旱生植物。前期研究发现,尽管生境中的土壤有效Na+含量极低且K+匮乏,霸王仍然能够通过吸收Na+,并将其作为渗透调节物质来抵御逆境胁迫,同时,还可以维持体内K+浓度的稳定。由此可见,霸王具有甜土植物所不可比拟的独特抗逆机制,是研究耐盐抗旱机制的理想材料。目前,霸王响应盐的分子机制尚缺乏系统研究,高亲和钾转运蛋白KUP/HAK/KT家族成员在霸王维持K+稳态平衡机制中的作用尚不清楚,关键Na+、K+转运蛋白在整株水平上的协同作用仍有待进一步解析。因此,本研究基于比较转录组分析霸王根中响应盐的差异表达基因;基于转录组鉴定得到霸王ZxKUP7和ZxKUP6,并对二者编码的转运蛋白进行功能分析;进一步解析了ZxNHX1对盐处理下霸王体内Na+、K+转运关键基因表达的调控作用。取得如下主要结果:1.基于RNA-Seq,比较了霸王和拟南芥（Arabidopsis thaliana）在50 mM NaCl处理下根中的差异表达基因。从差异表达基因的数量上来看,霸王的大量转录本在盐处理下迅速受到诱导,相比于拟南芥能够更快速的响应盐刺激。GO功能注释表明,50 mM NaCl对于霸王是一种刺激,而对于拟南芥却是胁迫;KEGG代谢通路分析表明,50 mM NaCl使霸王体内糖代谢增强,却使拟南芥遭受胁迫并启动了防御程序。与拟南芥相比,霸王中大量的离子转运相关基因被诱导,揭示了其能够从环境中积极摄取Na+和其他营养物质的策略;过氧化物酶（POD）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的编码基因在霸王中显著受到盐的诱导,推测抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环在霸王活性氧清除中发挥关键作用;脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）合成途径中的关键基因在霸王和拟南芥中表现出相反的表达模式,生长素（IAA）响应基因在霸王中表现的尤为活跃。以上结果为解析霸王独特的耐盐机制提供了线索,为进一步挖掘霸王优良的抗逆基因资源奠定了基础。2.基于霸王转录组,克隆得到霸王K+转运蛋白编码基因ZxKUP7,其编码的蛋白与拟南芥AtKUP7相似性达76.4%,位于KUP/HAK/KT家族第Ⅴ系统发育簇,与AtKUP7同簇,定位于质膜。ZxKUP7在霸王根中高丰度表达,并受钾处理、盐处理和渗透胁迫的显著诱导。将ZxKUP7回补于拟南芥atkup7突变体,对转基因株系进行了耐盐抗旱性分析。耐盐性分析表明:在水培盐胁迫下,atkup7长势变差,由于其K+吸收能力降低,根与植株地上部中的K+浓度降低,而Na+浓度却增加,体内K+、Na+稳态平衡遭到破坏,将ZxKUP7回补于atkup7后,根系选择性吸收K+的能力增强,增加了根和地上部的K+浓度。土培盐胁迫下,atkup7的植株地上部生长受到显著抑制,莲座叶K+浓度显著降低,而Na+积累增加,光合能力降低,在atkup7中回补霸王ZxKUP7,可恢复植株对K+的吸收能力,降低了Na+的积累,通过维持植株体内K+、Na+稳态平衡,提高了植株的光合能力。抗旱性分析表明:干旱胁迫下,atkup7地上部K+积累减少,组织含水量下降,光合受到抑制;而将ZxKUP7回补于atkup7后,回补株系地上部K+浓度增加,组织含水量提高,光合增强。以上结果表明,ZxKUP7与AtKUP7功能相似,参与根系K+吸收,在维持霸王体内K+、Na+稳态平衡中发挥重要作用。3.基于霸王转录组,克隆得到霸王K+转运蛋白编码基因ZxKUP6,其编码的蛋白与拟南芥AtKUP6序列相似性达75.6%,位于KUP/HAK/KT家族第Ⅱ系统发育簇,与AtKUP6同簇,定位于质膜。在霸王根中主要表达的ZxKUP6,其转录受到钾处理、渗透胁迫和盐处理的显著诱导。在拟南芥野生型中超表达ZxKUP6,短期处理下超表达株系幼苗在渗透胁迫下长势显著优于野生型。经周期性干旱处理后,超表达株系地上部长势优于野生型,莲座叶中的K+浓度显著增加30%左右,且保持了较高的叶片相对含水量和叶绿素含量。推测ZxKUP6可能在将K+从根向植株地上部转运的过程中发挥作用,增加了K+在地上部的积累,进而提高了植株的抗旱性。4.以霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白编码基因ZxNHX1的RNAi株系（ZxNHX1-RNAi）与霸王野生型（WT）为材料,从整株水平上进一步分析了Na+、K+吸收转运关键基因在盐处理下的变化规律。ZxNHX1被干扰后,在50 mM NaCl处理下,根中向木质部薄壁细胞卸载Na+的ZxHKT1;1转录持续增加,而介导Na+吸收的ZxHKT1;2、Na+向木质部导管中装载的ZxSOS1及叶中Na+向叶肉细胞中装载的ZxHKT1;3的表达下调,表明干扰株系中Na+的吸收、向地上部的转运及向叶肉细胞的装载受到抑制。此外,ZxNHX1间接调节K+的吸收与转运,在50mM NaCl处理下,ZxAKT1、ZxKUP7、ZxKUP6和ZxSKOR在WT中转录增加,而在干扰株系中不受到诱导,表明其根中吸收K+的能力及向木质部中装载K+并将K+从根向植株地上部转运的能力均被削弱。综上所述,多浆旱生植物霸王具有独特的耐盐机制;ZxKUP7可能参与根系K+吸收,ZxKUP6可能参与K+从根向植株地上部的转运,二者在维持霸王体内K+、Na+稳态平衡中发挥作用;关键Na+、K+转运蛋白在霸王整株水平上能够协同发挥作用,进而调控Na+和K+的吸收转运。

论文目录

• 缩写词表
• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 国内外研究进展
•   1.1 离子稳态平衡与植物的耐盐性
• +吸收与转运相关蛋白'>  1.2 Na⁺吸收与转运相关蛋白
•     1.2.1 NHX1
•     1.2.2 SOS
•     1.2.3 HKT
•     1.2.4 CNGC
• +吸收与转运相关蛋白'>  1.3 K⁺吸收与转运相关蛋白
•     1.3.1 AKT
•     1.3.2 SKOR
•     1.3.3 KUP/HAK/KT
• +、K⁺关键转运蛋白在植物耐盐中的协同作用'>  1.4 Na⁺、K⁺关键转运蛋白在植物耐盐中的协同作用
•   1.5 RNA-Seq技术
•     1.5.1 RNA-Seq技术在解析植物耐盐机制中的应用
•     1.5.2 RNA-Seq技术在非模式植物中的应用
•   1.6 多浆旱生植物霸王耐盐、抗旱机制研究进展
• 第二章 比较转录组分析揭示霸王响应盐的独特机制
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 植物材料培养及处理方法
•     2.1.2 RNA-Seq测序
•     2.1.3 霸王、拟南芥差异基因表达数据获取
•     2.1.4 差异表达基因（DEGs）分析
•     2.1.5 对霸王进行重新注释,DEGs功能分类
•     2.1.6 Real-time qPCR验证
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 测序质量良好
•     2.2.2 盐处理下差异表达基因（DEGs）的总览
•     2.2.3 差异基因功能分类
•     2.2.4 差异基因代谢途径分类
•     2.2.5 关键的差异表达基因
•     2.2.6 霸王中特有的差异表达基因
•     2.2.7 测序结果与Real-time qPCR验证结果具有良好的相关性
•   2.3 讨论
•     2.3.1 霸王中独特的差异表达基因
•     2.3.2 霸王与拟南芥差异表达基因概况
•     2.3.3 霸王中的离子转运系统与拟南芥相比更为活跃
•     2.3.4 PODs和 GSTs在霸王ROS清除系统中发挥重要作用
•     2.3.5 ABA、GA合成及生长素响应基因在霸王与拟南芥中表现出截然不同的表达模式
•   2.4 小结
• 第三章 霸王钾转运蛋白ZxKUP7 的功能鉴定
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 材料
•     3.1.2 方法
•     3.1.3 数据分析
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 霸王转录组中的KUP/HAK/KTs
•     3.2.2 ZxKUP7 基因全长c DNA的克隆与序列分析
•     3.2.3 ZxKUP7 亚细胞定位于质膜
•     3.2.4 ZxKUP7 表达模式分析
•     3.2.5 获得了ZxKUP7 转基因拟南芥
•     3.2.6 ZxKUP7 转基因拟南芥生长表型
•     3.2.7 ZxKUP7 转基因拟南芥耐盐性分析
•     3.2.8 ZxKUP7 转基因拟南芥抗旱性分析
•   3.3 讨论
•     3.3.1 霸王ZxKUP7 基因编码KUP/HAK/KT家族钾转运蛋白
•     3.3.2 ZxKUP7 可能参与霸王对逆境的应答响应
• +吸收并降低Na⁺积累,增强转基因拟南芥耐盐性'>    3.3.3 ZxKUP7 通过增加K⁺吸收并降低Na⁺积累,增强转基因拟南芥耐盐性
• +在地上部的积累,提高转基因拟南芥抗旱性'>    3.3.4 ZxKUP7 通过增加K⁺在地上部的积累,提高转基因拟南芥抗旱性
•   3.4 小结
• 第四章 霸王钾转运蛋白ZxKUP6 的功能初步分析
•   4.1 材料和方法
•     4.1.1 材料
•     4.1.2 方法
•     4.1.3 数据分析
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 ZxKUP6 基因全长c DNA的克隆与序列分析
•     4.2.2 ZxKUP6 亚细胞定位于质膜
•     4.2.3 ZxKUP6 表达模式分析
•     4.2.4 获得了超表达ZxKUP6 的拟南芥株系
•     4.2.5 超表达ZxKUP6 株系的生长表型
•     4.2.6 超表达ZxKUP6 拟南芥抗旱性分析
•   4.3 讨论
•     4.3.1 霸王ZxKUP6 基因编码KUP/HAK/KT家族钾转运蛋白
•     4.3.2 ZxKUP6 可能参与霸王对逆境的应答响应
• +从根向地上部的转运'>    4.3.3 ZxKUP6 可能参与K⁺从根向地上部的转运
•   4.4 小结
• +、K⁺平衡关键基因表达分析'>第五章 霸王Zx NHX1-RNAi株系中Na⁺、K⁺平衡关键基因表达分析
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 材料培养
•     5.1.2 RNA提取
•     5.1.3 反转录
•     5.1.4 Real-time qPCR
•     5.1.5 数据统计与分析
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 ZxNHX1 在野生型及ZxNHX1-RNAi株系中的表达
• +吸收转运相关基因的表达'>    5.2.2 ZxNHX1 干扰影响了霸王中Na⁺吸收转运相关基因的表达
• +吸收转运相关基因的表达'>    5.2.3 ZxNHX1 干扰影响了霸王中K⁺吸收转运相关基因的表达
•     5.2.4 ZxNHX1 干扰影响了霸王中CNGCs的表达
•   5.3 讨论
• +吸收、转运相关基因的表达'>    5.3.1 ZxNHX1 调控霸王Na⁺吸收、转运相关基因的表达
• +吸收、转运关键基因的表达'>    5.3.2 ZxNHX1 间接影响霸王K⁺吸收、转运关键基因的表达
•     5.3.3 ZxNHX1 间接影响霸王CNGCs基因的表达
•   5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 在学期间（2013-2019 年）的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 柴薇薇

导师: 王锁民

关键词: 积盐型旱生植物,差异表达基因,转运,转运蛋白

来源: 兰州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 兰州大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27204/d.cnki.glzhu.2019.000050

总页数: 165

文件大小: 5557K

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