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草鱼Bcl-xl基因的转录调控及抗凋亡功能分析

2020-12-08阅读(261)

草鱼Bcl-xl基因的转录调控及抗凋亡功能分析

论文摘要

众所周知,Bcl-xl,Bax2和NF-κB参与抗凋亡反应。尽管在一些鱼中已经报道了Bcl-xl,但NF-κB介导的调节机制和细胞抗凋亡功能仍不清楚。本实验我们克隆了草鱼（Ctenopharyngodon idella）Bcl-xl（CiBcl-xl）的全长cDNA序列及其启动子序列。CiBcl-xl的全长cDNA为2836bp,ORF为627bp,编码208个氨基酸的多肽。系统进化树分析显示CiBcl-xl与Dario rerio Bcl-xl（Dr Bcl-xl）具有高度同源性。在用poly I:C刺激后,CIK细胞和各组织中CiBcl-xl的表达显著上调,这说明CiBcl-xl在抗病毒免疫机制中有重要作用。之后为了进一步理解NF-κB对Bcl-xl的转录调控,在大肠杆菌BL21中大量表达CiC-rel和Cip65,并通过Ni-NTA His-Bind树脂的亲和层析纯化。在体外,凝胶阻滞实验分析证明了CiC-rel和Cip65与CiBcl-xl启动子的高亲和力。双荧光素酶报告基因检测显示CiC-rel和Cip65都能激活CiBcl-xl启动子。因此,与哺乳动物类似,鱼类C-rel和p65也可以上调Bcl-xl的转录。相反,敲降了C-rel或p65都能够降低Bcl-xl表达。我们还发现在草鱼肾细胞（CIK）中CiBcl-xl的过表达可以增加细胞活性并抵抗细胞凋亡,而Bax2的过表达后的功能恰好相反。同时,细胞中CiBcl-xl和CiBax2的共转染可以缓解细胞凋亡率。为了进一步研究Bcl-xl和Bax2协同作用的分子基础,我们进行了GST-Pulldown分析,并显示Bcl-xl和Bax2可以相互结合。我们的研究结果表明,基因Bcl-xl是NF-κB通路中下游的一个重要的抗凋亡基因。这为我们以后更深入的研究草鱼机体的凋亡机制提供了一个可参考的依据。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 前言
  •   1.1 Bcl-2 家族
  •   1.2 Bcl-xl的结构及其功能
  •   1.3 Bcl-xl信号传导通路
  •     1.3.1 Bcl-xl转录水平
  •     1.3.2 Bcl-xl蛋白水平
  •   1.4 Bcl-xl的研究进展
  •   1.5 研究的目的与意义
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 细胞株、载体与菌种
  •     2.1.2 实验仪器设备
  •     2.1.3 主要试剂和试剂盒
  •     2.1.4 引物表
  •     2.1.5 相关软件
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 草鱼Bcl-xl全长c DNA的克隆
  •     2.2.2 草鱼Bcl-xl启动子的克隆
  •     2.2.3 草鱼Bcl-xl的系统进化分析
  •   2.3 草鱼Bcl-xl在 CIK细胞中与组织中的表达水平分析
  •     2.3.1 草鱼Bcl-xl在组织中的表达分析
  •     2.3.2 草鱼Bcl-xl在 CIK细胞中的表达分析
  •   2.4 草鱼C-rel、p65 原核表达载体构建及蛋白纯化
  •     2.4.1 原核表达载体
  •     2.4.2 小量诱导
  •     2.4.3 大量表达及蛋白纯化
  •   2.5 草鱼Bcl-xl真核表达载体构建
  •   2.6 草鱼C-rel、p65与Bcl-xl启动子序列的亲和性分析
  •   2.7 细胞转染及双荧光素酶分析
  •     2.7.1 细胞转染
  •     2.7.2 荧光素酶活性检测
  •   2.8 草鱼肾细胞（CIK）C-rel、p65 的敲降（knock-down）
  •     2.8.1 Ci C-rel、Cip65的siRNA设计
  •     2.8.2 siRNA片段转染CIK细胞
  •     2.8.3 草鱼C-rel、p65 敲降后Bcl-xl的转录水平检测
  •   2.9 细胞活力和细胞凋亡检测
  •     2.9.1 细胞活力测定
  •     2.9.2 细胞凋亡检测
  •   2.10 GST-pull down实验
  • 第三章 结果与分析
  •   3.1 草鱼Bcl-xl的克隆及其分析
  •     3.1.1 草鱼Bcl-xl全长c DNA的克隆
  •     3.1.2 草鱼Bcl-xl基因测序结果分析
  •     3.1.3 草鱼Bcl-xl基因的系统进化分析
  •   3.2 草鱼Bcl-xl启动子的克隆及其分析
  •   3.3 草鱼Bcl-xl基因的定量表达分析
  •   3.4 草鱼C-rel、p65与Bcl-xl的启动子亲和性分析
  •   3.5 草鱼Bcl-xl的转录调控分析
  •     3.5.1 检测草鱼Bcl-xl启动子活性
  •     3.5.2 草鱼C-rel、p65对Bcl-xl基因的转录调控分析
  •   3.6 草鱼C-rel、p65 敲降后Bcl-xl的转录表达分析
  •   3.7 过表达Ci Bcl-xl能增加细胞活力并抑制细胞凋亡
  •   3.8 Ci Bcl-xl-FLAG标签的检测及Ci Bcl-xl和 Ci Bax2 的相互作用
  • 第四章 讨论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 齐国琴

    导师: 胡成钰

    关键词: 抗凋亡,草鱼

    来源: 南昌大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 南昌大学

    分类号: Q953

    DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.001829

    总页数: 56

    文件大小: 2852K

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