与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定

论文摘要

【背景】猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）膜蛋白（M）在病毒粒子的组装、膜融合和病毒复制等方面具有重要的作用,但M蛋白与宿主细胞的互作机制尚不清楚。【目的】利用免疫沉淀技术和液质联用技术筛选细胞内与PEDVM蛋白相互作用的蛋白,为揭示M蛋白在病毒增殖过程中发挥的功能提供研究基础。【方法】将MOI=0.1的PEDV DR13疫苗株接种于长成单层的Vero细胞,感染36 h后,收集细胞并进行裂解。利用抗M的单克隆抗体沉淀与M相互作用蛋白复合物,通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行鉴定并利用细胞功能富集分析（Gene ontology,GO）对感染组鉴定到的细胞蛋白进行分析,确定两个细胞内源性蛋白为候选蛋白,进行免疫共沉淀（Co-IP）验证和共定位分析。【结果】基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,感染组与对照组相比,鉴定了218个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关,选择细胞分裂周期蛋白42 （Cell division cycle 42,CDC42）、真核翻译起始因子3亚基L蛋白（eIF3L）为候选蛋白进行Co-IP（Co-immunoprecipitation）验证和共定位分析,结果证实CDC42、eIF3L蛋白分别与M蛋白在细胞内存在相互作用。【结论】鉴定出PEDV M蛋白能够与宿主细胞CDC42和eIF3L蛋白相互作用,并鉴定出其他可能与M蛋白发生相互作用的宿主蛋白60个,为开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用研究提供了重要理论依据。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 病毒和细胞
•   1.2 主要试剂和仪器
•   1.3 PEDV M蛋白表达量检测
•   1.4 IP试验筛选细胞内与M蛋白相互作用的蛋白
•   1.5 质谱分析差异蛋白
•   1.6 重组质粒的构建
•   1.7 Co-IP
•   1.8 Western blot鉴定
•   1.9 免疫荧光 （IFA） 鉴定
• 2 结果与分析
•   2.1 PEDV感染后M蛋白在细胞中的表达
•   2.2 免疫沉淀样品的质谱分析
•   2.3 Co-IP验证与PEDV M相互作用的蛋白
•   2.4 PEDV M蛋白与CDC42/eIF3L定位分析
• 3 讨论与结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王瑞阳,于瑞嵩,陈冰清,李凤平,谢春芳,司伏生,董世娟,李震

关键词: 免疫共沉淀,猪流行性腹泻病毒,膜蛋白,蛋白互作

来源: 微生物学通报 2019年06期

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 上海海洋大学水产与生命学院,上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海农业遗传育种重点实验室

基金: 国家自然科学基金(31602060),上海市农业科学院学科领域建设专项(31602060-2016匹配),国家重点研发计划(2016YFD0500101),上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字(2015)第6-1-9号)~~

分类号: S852.651

DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190019

页码: 1434-1442

总页数: 9

文件大小: 1408K

下载量: 306