基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统的初步研究

论文摘要

A组轮状病毒（Rotavirus）是全球范围内引起婴幼儿肠胃炎的主要病原体之一,每年导致200万住院病例和20万死亡病例,造成了严重的社会经济负担。目前关于轮状病毒复制、致病及免疫机制等相关基础研究相对较少,主要原因是缺乏高效的轮状病毒反向遗传学系统。2017年,Komoto等建立了基于14质粒的轮状病毒反向遗传学系统。但是,目前该系统还存在效率低、所得病毒滴度较低等问题。并且,除了Komoto实验室,还没有其他实验室成功利用该系统进行病毒研究的相关报道。为了建立基于质粒的反向遗传学系统,我们按照Komoto的思路进行了 14质粒反向遗传学系统的构建尝试,但14质粒共转染细胞后未能产生感染性病毒颗粒,且未检测到病毒蛋白的表达。随后,我们对14质粒系统进行了优化。首先对转染细胞系和转染试剂进行了优化,确定所用细胞系为B SR-T7/5,所用转染试剂为XtremeGENE;其次,由于病毒双层颗粒转导细胞后可产生感染性病毒颗粒,我们尝试将病毒双层颗粒组成蛋白VP1、VP2、VP3、VP6加入反向遗传学系统。然而VP1、VP2、VP3、VP6表达质粒与1 1个转录质粒共转染后未能获得病毒颗粒;最后,考虑到14质粒共转染数量太多,转染效率低,我们设计克隆将轮状病毒的11个转录质粒减少到四个。蛋白表达情况检测结果显示四个转录质粒共转染细胞后VP2和VP6表达量均高于11质粒,并且电镜观察到胞内存在少许类病毒颗粒,但未观察到明显的病毒质区。检测NSP2蛋白表达情况,我们发现胞内无NSP2蛋白表达,这可能是未形成病毒质区的原因。另外,我们对转录质粒转录情况进行了检测,发现转录质粒所转录出的病毒RNA 3’末端存在非病毒序列。病毒基因3’末端序列准确性会直接影响基因组包装,并进一步影响到病毒颗粒的生成。综上所述,优化后的四质粒系统比14质粒系统蛋白表达水平更高,共转染细胞后可观察到少许类病毒颗粒。另外,我们发现病毒质区的形成和病毒基因序列3’末端序列准确性会直接影响重组病毒的产生。因此,本研究为建立更高效的基于质粒的反向遗传学系统提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 前言
•   1 轮状病毒概况
•     1.1 轮状病毒的基因组
•     1.2 轮状病毒的蛋白
•     1.3 轮状病毒的分类及命名
•   2 轮状病毒的流行病学
•     2.1 轮状病毒致病流行情况
•     2.2 轮状病毒流行趋势变化
•   3 轮状病毒的感染及致病机制
•     3.1 轮状病毒的感染
•     3.2 轮状病毒致病机制
•   4 反向遗传学研究进展
•     4.1 反向遗传学简介
•     4.2 反向遗传学系统研究现状
•     4.3 反向遗传学系统的应用
•     4.4 轮状病毒反向遗传学系统研究进展
•   5 本研究目的及意义
• 第二章 材料与方法
•   1 材料
•     1.1 主要仪器
•     1.2 菌种、质粒、细胞、毒株及实验动物
•     1.3 主要试剂
•   2 方法
•     2.1 常用溶液配制
•     2.2 分子克隆实验
•     2.3 蛋白表达
•     2.4 SDS-PAGE鉴定
•     2.5 抗体制备
•     2.6 抗体的HRP标记实验
•     2.7 体外转录及RNA鉴定
•     2.8 细胞培养及传代
•     2.9 感染性克隆转染及后续感染细胞
•     2.10 流式细胞术筛选阳性细胞
•     2.11 蛋白免疫印迹（Western Blotting）
•     2.12 酶联免疫吸附实验（ELISA）
•     2.13 病毒培养
•     2.14 病毒感染滴度测定
• 第三章 结果与分析
•   1 轮状病毒14质粒反向遗传学系统的建立尝试
•     1.1 轮状病毒反向遗传学操作系统11个转录质粒的构建
•     1.2 轮状病毒反向遗传学操作系统3个辅助质粒的构建
•     1.3 稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系构建
•     1.4 质粒共转染细胞尝试
•   2 轮状病毒反向遗传学系统优化
•     2.1 转染试剂优化
•     2.2 转染细胞系优化
•     2.3 VP1、VP2、VP3、VP6蛋白对反向遗传学系统的影响
•     2.4 转染质粒数量优化
• 第四章 讨论
•   1 建立基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统的难点
•   2 HDV核酶长度对其自剪切效率的影响
•   3 病毒非结构蛋白对反向遗传学系统的影响
• 第五章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 在学期间主要科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵毕妍

导师: 葛胜祥,李廷栋

关键词: 轮状病毒,反向遗传学,感染性克隆

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 厦门大学

分类号: R373.2

总页数: 79

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