林麝源肺炎克雷伯氏菌GPKP基因kp05372缺失株的构建及其生物学特性分析

论文摘要

肺炎克雷伯氏菌是重要的条件致病菌,可导致林麝肺炎,从而引起死亡。肺炎克雷伯氏菌中的LysR型转录调控因子可参与调控其毒力、分解代谢、耐药性等。本研究通过构建林麝源肺炎克雷伯氏菌GPKP中新发现的LysR型转录调控基因的缺失株及回补株,比较三者的生长曲线、药敏试验、生物被膜、抗逆性、细菌半数致死量、定殖能力及其引起的器官病理形态学等生物学特性的差异,探究该转录调控因子的基本功能,主要试验结果如下:1.林麝源肺炎克雷伯氏菌基因kp05372缺失株及回补株的构建:扩增基因kp05372上下游同源臂,交叠PCR获得融合片段,以pLP12T质粒为载体,通过无缝克隆连接,成功构建重组自杀质粒。通过接合转移,在氯霉素压力正向筛选及阿拉伯糖诱导反向筛选下,经两次同源重组,最终成功筛选到缺失株GPKP-△kp05372。以质粒pBAD33为载体克隆连接敲除基因片段kp05372,成功构建回补表达质粒pBAD33-KP。通过接合转移,阿拉伯糖诱导调节基因表达量,成功筛选到回补株GPKP-△kp05372+。2.林麝源肺炎克雷伯氏菌生物学特性分析:三株菌生长速率无显著差异,均表现为2 h后迅速增长,12 h达到最大,持续至18 h后,活菌量逐渐下降;野生株及回补株生物被膜形成能力强于缺失株;缺失株对头孢噻吩、复方新诺明及多粘菌素B产生了耐药性,对庆大霉素、氧氟沙星等的抑菌圈直径缩小5 mm以上,对新霉素的抑菌圈直径则增大5 mm以上;三株菌在不同的渗透压、温度、盐含量及过氧化氢浓度下无显著变化。在pH=2-7范围内,随pH值升高,缺失株耐酸能力逐渐下降;野生株、缺失株及回补株对小鼠的半数致死量分别为6.3×107CFU/mL、1.1×1010CFU/mL、4.88×109CFU/mL;肝脏中三株菌的含量下降后保持稳定定殖,心脏、脾脏、肾脏及肠道中缺失株含量最先下降为0,定殖能力最弱;三株菌均能引起肝、肺的严重组织病理变化。综上所述,本研究成功构建GPKP基因缺失株GPKP-△kp05372及回补株GPKP-△kp05372+。比较生物学特性差异发现该基因缺失导致GPKP生物被膜形成能力下降,耐药性发生变化,毒力下降,还可能参与调控GPKP的抗酸性机制。为进一步研究LysR型转录调控因子GPKP基因kp05372的调控机制做铺垫。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述及研究目的和意义
•   1 林麝的研究概况
•     1.1 林麝的现状
•     1.2 林麝常见疾病的研究现状
•   2 肺炎克雷伯氏菌的生物学特征研究概况
•     2.1 病原学
•     2.2 流行病学
•     2.3 耐药机制
•     2.4 致病性
•   3 LysR型转录因子研究进展
•     3.1 LysR型转录因子的基本结构特征
•     3.2 LysR蛋白转录调控模式
•     3.3 LysR家族转录因子的主要功能
•     3.4 肺炎克雷伯氏菌中的LysR家族转录因子
•   4 肺炎克雷伯氏菌基因缺失技术概况
•     4.1 λ Red重组技术
•     4.2 自杀载体同源重组技术
•     4.3 插入突变基因技术
•   5 研究的目的与意义
• 第二部分 研究内容
•   第一章 林麝源肺炎克雷伯氏菌GPKP基因KP05372 缺失株GPKP-△KP05372 及回补株GPKP-△KP05372+的构建
•     1 试验材料
•       1.1 主要菌株及质粒
•       1.2 主要试剂
•       1.3 主要仪器
•     2 试验方法
•       2.1 缺失株及回补株引物设计
•       2.2 pLP12-KP自杀质粒的构建
•       2.3 林麝GPKP-△kp05372 缺失株的构建
•       2.4 pBAD33-KP回补表达质粒构建
•       2.5 林麝GPKP-△kp05372+回补株的构建
•     3 试验结果
•       3.1 pLP12-KP自杀质粒的构建
•       3.2 林麝GPKP-△kp05372 缺失株的构建
•       3.3 pBAD33-KP回补表达质粒构建
• +回补株的构建'>      3.4 林麝GPKP-△kp05372⁺回补株的构建
•     4 讨论
•   第二章 林麝源肺炎克雷伯氏菌基因缺失株、回补株及野生株生物学特性对比研究.
•     1 试验材料
•       1.1 主要菌株及试验动物
•       1.2 主要试剂
•       1.3 主要仪器
•     2 试验方法
•       2.1 生长曲线测定
•       2.2 药敏试验
•       2.3 生物被膜检测
•       2.4 抗逆性的检测
• 50 检测'>      2.5 细菌半数致死量LD₅₀检测
•       2.6 细菌定殖能力检测
•       2.7 组织病理学观察试验
•     3 试验结果
•       3.1 生长曲线测定
•       3.2 药敏试验
•       3.3 生物被膜检测
•       3.4 抗逆性的检测
• 50 检测'>      3.5 细菌半数致死量LD₅₀检测
•       3.6 细菌定殖能力检测
•       3.7 组织病理学观察
•     4 讨论
•       4.1 生长速率
•       4.2 生物被膜
•       4.3 药敏试验
•       4.4 抗逆性
• 50'>      4.5 细菌半数致死量 LD₅₀
•       4.6 细菌定殖能力
•       4.7 组织病理学观察
• 第三部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王吴优

导师: 罗燕

关键词: 林麝,肺炎克雷伯氏菌,转录因子,基因,生物学特性

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

基金: 四川省2016年学术和技术带头人培养资助项目

分类号: S852.61

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000983

总页数: 83

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