牛支原体武威分离株eno基因的克隆、表达及酶活测定

论文摘要

牛支原体（Mycoplasma bovis, Mb）是引起肉牛（Bos taurus）和奶牛疾病的重要病原之一,给养牛业造成了重大的经济损失。烯醇化酶（enolase, eno）为糖酵解途径的关键限速酶,主要催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。为研究Mb eno酶促活性及其动力学参数,本研究参照GenBank中Mb PG45株eno基因（NC014760.1）序列设计特异性引物,应用PCR扩增获得Mb武威分离株的eno基因。在序列分析及基因优化的基础上,构建其原核表达载体p ET-eno并转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌Transetta（DE3）,经异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）诱导表达,在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE）分析的基础上,纯化表达产物对其酶促活性进行分析。结果表明,优化后的Mb武威株eno基因在大肠杆菌中成功获得表达,重组蛋白His-eno大小约为53 kD,且主要以可溶性蛋白形式存在;酶活分析结果显示:纯化产物His-eno的催化活性略高于兔肌肉烯醇化酶,且其最适温度为42℃,最适pH为8.0。双倒数作图所得Hiseno米氏常数（Km）和最大反应速率(Vmax)分别为4.1×10-3mol/L和3.4μmol/（L·min）。本研究结果为进一步研究Mb eno的生物学功能提供基础资料。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌种与载体
•   1.2 主要试剂
•   1.3 Mb武威株的培养及提取基因组
•   1.4 烯醇化酶基因的扩增、生物信息学分析及优化
•   1.5 原核表达载体pET-eno的构建
•   1.6 pET-eno原核表达及表达产物的纯化
•   1.7 His-eno的酶活性分析
•     1.7.1 His-eno酶活性的测定
•     1.7.2 His-eno浓度对酶活性的影响
•     1.7.3 温度对His-eno酶活性的影响
•     1.7.4 pH对His-eno酶活性的影响
•     1.7.5 底物浓度对His-eno酶活性的影响
• 2 结果与分析
•   2.1 烯醇化酶基因扩增、生物信息学分析及优化
•   2.2 原核表达载体pET-eno的构建
•   2.3 pET-eno表达及纯化
•   2.4 His-eno酶活性的测定
•   2.5 His-eno浓度对酶活性的影响
•   2.6 温度对His-eno酶活性的影响
•   2.7 pH对His-eno酶活性的影响
•   2.8 底物浓度对His-eno酶活性的影响
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 高翔,王昱茜,邢小勇,魏彦明,包世俊

关键词: 牛支原体,烯醇化酶,原核表达,酶活性

来源: 农业生物技术学报 2019年05期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 甘肃农业大学动物医学院

基金: 国家自然科学基金(No.31360620),国家肉牛,牦牛产业技术体系项目(CARS-37)

分类号: S852.62

页码: 936-942

总页数: 7

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