水葫芦磷转运蛋白基因EcPHT的克隆、功能研究及表达分析

论文摘要

水葫芦(Eichhornia crassipes)是一种外来入侵植物,它能够高效吸收氮和磷,因此在富营养化水体中能够快速生长。它的疯长破坏了水体生态平衡,造成很大经济损失,但控制种养水葫芦,又可以利用它来净化水质,因此研究水葫芦磷转运蛋白基因(Eichhornia crassipes phosphate transporter,EcPHT),有利于揭示水葫芦对富营养化水体中磷吸收的分子机理,揭示水葫芦快速入侵的分子机理,为水葫芦合理开发和利用提供理论基础。磷(Phosphorus,P)是植物生长发育过程中不可缺少的营养元素,是核酸、ATP、磷脂的重要组成之一。研究水葫芦运蛋白基因能够为高效吸收磷的经济作物高效磷吸收提供借鉴,能够为优良农作物的遗传育种提供新的基因资源。本文利用二十多种植物的高亲和力磷转运蛋白(Phosphate Transporter 1,PHT1)基因保守序列设计出简并引物,克隆出水葫芦EcPHT中间片段710 bp。利用RACE技术,获得EcPHT基因的5’端和3’端片段,EcPHT基因全长序列通过拼接获得。EcPHT基因完整的开放阅读框1572 bp,编码523个氨基酸,该基因的分子量为57.009 kD,等电点为8.95,含有信号肽和11个跨膜区,是一个稳定、疏水蛋白。EcPHT基因的结构与MFS转运子和糖转运子相似度很高,该基因的氨基酸序列与油棕、铁皮石斛、枳壳、柑橘植物PHT1基因相似度达到80%以上。通过酵母功能互补试验,验证了175μMP时EcPHT基因能够互补磷缺陷型酵母菌PHO84的功能,揭示该基因能够转运磷。在不同pH值条件下生长,缺陷型酵母菌PHO84最适合生长的pH值为6,酸性条件有利于磷转运蛋白突变体酵母的生长。用叶盘转化法将农杆菌EHA105介导的EcPHT基因转到烟草中,转基因烟草的根数比野生型多,苗的健壮程度也比野生型的好,其中转基因中烟100烟草结果比较显著。在0.1 mMP低磷条件下,转基因烟草比野生型烟草生长得好。利用荧光定量PCR方法检测不同培养条件下EcPHT基因在水葫芦和转基因烟草根部和叶子中的表达量,以及烟草自身磷转运蛋白(Nicotiana tabacum phosphate transporter,NtPHT)和烟草低磷胁迫相关转录因子(Nicotiana tabacum phosphate starvation response,NtPHR)在转基因烟草中的表达情况。实验结果显示缺磷胁迫下能够提高水葫芦根部EcPHT基因的表达能力,在0 mMP条件下,72 h时EcPHT基因在水葫芦根部表达量明显增加。水葫芦在缺磷下培养后转到1 mMP下培养,EcPHT基因在水葫芦叶子中表达受抑制。在MS培养40天后,相对野生型烟草EcPHT基因在转基因中烟100烟草根部和叶子中明显表达,根中NtPHT基因表达量在转基因中烟100烟草中显著升高而在转基因YK180烟草中略下降,NtPHR基因表达量在转基因中烟100烟草根部和叶子中都略升高。磷浓度为0.1 mM时,可促进NtPHT基因在中烟100烟草根中表达,是NtPHT基因在转基因YK180烟草根中表达量最高的磷浓度,而野生型YK180根中表达量最高的磷浓度为MS培养液。在2 mMP条件下,抑制了EcPHT基因在转基因中烟100烟草根部和叶子中表达,而提高NtPHR基因在转基因中烟100烟草根和叶中的表达能力。运用钼蓝比色法检测水葫芦和转基因烟草在不同磷浓度条件下培养的湿重无机磷含量以及转基因烟草不同生长时间的磷含量。第1天时水葫芦根部和叶子中的湿重磷含量受外界磷浓度影响大,1 mMP条件下水葫芦叶子无机磷含量随着时间的增长而增加。随着磷浓度增加,烟草根中的无机磷含量越高,随着生长时间越长,转基因烟草叶子无机磷含量越高。在MS培养30和40天后,农杆菌侵染的烟草叶子中的总磷含量都比根部高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 水葫芦的概况
•     1.1.1 水葫芦的简介
•     1.1.2 水葫芦研究状况
•   1.2 植物体内的磷元素
•     1.2.1 磷元素在植物体内的生理作用
•     1.2.2 植物对磷的吸收和转运机制
•   1.3 植物磷转运相关蛋白基因的研究进展
•     1.3.1 植物磷转运蛋白基因的类型
•     1.3.2 植物磷转运蛋白的功能鉴定
•     1.3.3 植物PHT1 家族的研究进展
•     1.3.4 植物PHR1 家族的研究进展
•   1.4 研究目的、意义及内容
•     1.4.1 研究目的和意义
•     1.4.2 研究的内容
• 第二章 水葫芦磷转运蛋白基因EcPHT全长的克隆及序列分析
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与试剂
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 实验试剂盒与酶
•     2.2.3 化学试剂
•     2.2.4 培养基配方与菌种
•     2.2.5 主要实验仪器
•     2.2.6 引物
•   2.3 主要实验方法
•     2.3.1 水葫芦EcPHT中间片段的克隆
•     2.3.2 EcPTT基因RACE克隆
•     2.3.3 EcPTT基因的全长克隆
•     2.3.4 基因序列分析
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 实验结果电泳图
•     2.4.2 水葫芦EcPHT基因序列的分析
•   2.5 讨论
• 第三章 水葫芦EcPHT基因在酵母表达系统的功能鉴定
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验菌种与质粒
•     3.2.2 实验试剂与试剂盒
•     3.2.3 培养基配方
•     3.2.4 引物
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 质粒PYES2 的提取
•     3.3.2 载体构建
•     3.3.3 酵母感受态制备、转化
•     3.3.4 酵母中的质粒提取
•   3.4 实验结果与分析
•     3.4.1 实验结果电泳图
•     3.4.2 酵母功能互补实验结果
•     3.4.3 不同pH值和时间下酵母菌生长状况
•   3.5 讨论
• 第四章 水葫芦EcPHT的表达研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料与方法
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 实验方法
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 Real-time PCR标准曲线
•     4.3.2 EcPHT基因在水葫芦体内的表达情况
•     4.3.3 水葫芦湿重无机磷含量测量
•   4.4 讨论
• 第五章 农杆菌介导的水葫芦EcPHT基因转化烟草
•   5.1 引言
•   5.2 实验材料与方法
•     5.2.1 实验材料
•     5.2.2 实验方法
•   5.3 实验结果与分析
•     5.3.1 实验结果电泳图
•     5.3.2 烟草生长情况
•   5.4 讨论
• 第六章 EcPHT转基因烟草中磷转运蛋白基因及相关基因的表达研究
•   6.1 引言
•   6.2 实验材料与方法
•     6.2.1 实验材料
•     6.2.2 实验方法
•   6.3 实验结果
•     6.3.1 Real-time PCR标准曲线
•     6.3.2 NtPHT、NtPHR、EcPHT基因荧光定量PCR结果分析
•     6.3.3 转基因烟草磷含量的测量
•   6.4 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢
• 附录1 EcPHT基因保守序列片段BLAST比对
• 附录2 烟草actin序列片段
• 附录3

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 钟燕珊

导师: 傅明辉

关键词: 水葫芦,磷转运蛋白,荧光定量,磷含量,功能分析

来源: 广东工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 广东工业大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27029/d.cnki.ggdgu.2019.000223

总页数: 114

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